場景恐懼實驗分析系統實驗
場景恐懼實驗系統(FCS)用于小型嚙齒類動物(大、小鼠)環境相關條件性恐懼實驗研究。嚙齒類動物在恐懼時會表現出*的不動狀態(immobility),動物在這種情況下傾向于保持靜止不動的防御姿勢。抗抑郁藥和抗中樞興奮藥可以明顯縮短不動狀態持續的時間。實驗過程中,實驗對象被給與一個聲音信(條件刺激),隨后給予(非條件)刺激。該訓練稱為條件性訓練,訓練結束后實驗動物進行聲音信號或環境聯系性實驗。一般情況下嚙齒類動物對相應的環境和不同環境下同樣的聲音信號都會做出明顯的條件性恐懼反應,如靜止不動。這種測試可以在訓練結束后立刻或幾天后進行可以提供在條件信號影響下短期和*記憶的信息。
場景恐懼實驗介紹:
場景恐懼是基于巴普洛夫條件反射而建立的。它測定動物學習、記憶不悅經歷和環境暗示之間關聯的能力。常用聲音或光暗示作為條件以厭惡性刺激作為非條件刺激二者配對出現。經過這種CS-US訓練,動物不僅學會聲音和之間存在聯系,而且知道和周圍環境之間也存在某種聯系。前者為聽覺暗示條件恐懼或暗示條件恐懼后者為關聯條件恐懼。恐懼是非靈長類動物少有的幾種情感反應。動物經歷條件恐懼后,當再次接觸條件刺激時,會產生一系列的生理反應,包括自主神經緊張、應激激素分泌增加以及防御行為增多,等等。凝滯即是動物防御行為的一種,是指動物除呼吸之外沒有任何其他活動,猶如在黑夜處于迎面而來的汽車強燈照射之下的驚鹿,一動不動。它被認為是評價嚙齒類動物恐懼的可靠指標。
參與條件關聯學習過程的腦部結構主要為杏仁核和海馬。前者調節恐懼,后者調節與恐懼性事物相關聯的學習認知。所以,這一模型主要用于杏仁核和海馬依賴的記憶。動物不需要禁水或禁食,且實驗設備較為簡單,訓練時間相對較短。因此,該模型廣泛用于轉基因小鼠敲除小鼠的行為表型研究。
場景恐懼實驗分析系統分為三個階段:
階段:條件性訓練(1 天) 無刺激 180s
聲音信號 30s 2s 無刺激 20s
階段為訓練實驗,實驗動物被給與條件性 聲音刺激。
第二階段:環境相關(2 天) 無刺激 180s
第二階段將實驗動物放入階段中的環境中
以期評價環境相關的條件性恐懼程度。
第三階段:改變的環境相關信息(2 天+2h) 無刺激 180s 聲音 180s 無刺激 60s
改變環境信息(比如在實驗箱中放入一個分隔板、改變光源和背景噪音或用其他溶液清洗實驗箱等)后觀察動物的條件性恐懼程度。刺激的順序由實驗者決定。實驗結束后通過軟件系統對記錄的數據進行分析。以上的實驗中,第二階段沒有給與任何刺激但是實驗動物表現出明顯的環境相關性恐懼。在第三階段,同一只動物在改變了環境后沒有表現出任何不動反應(活動性減少),但是在給與聲音信號后,可以觀察到明顯地條件性恐懼反應。
場景恐懼實驗結算與分析:
因為不同類型的學習凝滯時間不同,所以*常使用百分計:
關聯=(關聯測試中的凝滯得分/30)*
變更關聯(條件刺激前)=(變更關聯中的凝滯得分/18)*
聽覺暗示(條件刺激)=(聽覺條件刺激中凝滯得分/18)*
對每一不同的凝滯測試計分進行重復測量單因素方差分析(ANOVA),從此比較關聯和變更關聯或聽覺暗示之間的條件恐懼程度,并確定組間差異。一般而言,動物在聽覺暗示中的凝滯行為要比關聯測試的多。在變更關聯測試中,由于關聯條件箱已被改造得“面目全非”,訓練時動物獲得的對周圍環境的關聯幾乎不存在,因此,凝滯行為應該*少。關聯與變更關聯差別很大,凝滯計分差別越大。
如果動物在第二天的關聯測試和聽覺暗示測試中出現凝滯,而在變更關聯測試中不表現凝滯行為,則可認定:動物的感覺和運動功能均正常;能記住前一天與厭惡刺激配對出現的暗示信號;能分辨前一天不與厭惡刺激配對出現的暗示信號,說明動物具有正常的記憶。這些測試中的任何一項增強或減弱,提示調節記憶情感部分的神經解剖、神經遞質和基因可能發生變化。
場景恐懼實驗硬件:
由鋁合金、科研有機玻璃制成,方便拆卸更換,無毒無味,外觀美觀堅固耐用。實驗環境由場景集控器控制,集控器集成了通風扇、蜂鳴器、LED 白光燈和紅外燈等,安裝于實驗箱頂蓋上,用來提供實驗所需的環境及條件性刺激信號。2 條件控制器:用于人工控制聲音發生、
光源、電刺激等3 器:條件性恐懼器(與金屬柵欄相連),另一端與控制器相連。裝有模塊的微處理器提供持續的電流刺激,通過軟件可調刺激電流。
場景恐懼實驗方法設備:
包括條件恐懼箱、隔音箱和關聯條件箱,條件恐懼箱包括與箱底格柵地板相聯的發生器(可產生0.1~1.0mA的各種強度的)、聲音發生器(可產生寬頻的卡嗒聲或低頻音),并與計算機相聯。隔音箱裝有一燈、一小風扇(用于通風和產生背景音)以及一個與聲音發生器相聯的擴音器。隔音箱門上有一貓眼,用于觀察操作箱內的動物。一個隔音箱內可放置兩個操作箱,這樣可同時觀測兩只動物,但兩動物彼此不能互相看見。關聯箱由透明有機玻璃制成,有可移動的格柵式地板和紗窗式頂部。為防止動物滑至格柵下面,格柵條之間距離應足夠短。對小鼠和年幼大鼠,關聯條件箱通常為26cm*21cm*10cm;格柵地板由不銹鋼條(直徑1.5mm,*間距小鼠為0.5cm、年幼大鼠為1.2cm)組成。對成年大鼠,關聯箱通常為29cm*23.5cm*19.5cm,格柵地板包括16根不銹鋼條(直徑2.5cm、*間距為1.25cm)。此外,還有電壓計和聲強計,用來檢測刺激強度。
場景恐懼實驗計算方法與實驗:
因為不同類型的學習凝滯時間不同,所以*常使用百分計:
關聯=(關聯測試中的凝滯得分/30)*
變更關聯(條件刺激前)=(變更關聯中的凝滯得分/18)*
聽覺暗示(條件刺激)=(聽覺條件刺激中凝滯得分/18)*
對每一不同的凝滯測試計分進行重復測量單因素方差分析(ANOVA),從此比較關聯和變更關聯或聽覺暗示之間的條件恐懼程度,并確定組間差異。一般而言,動物在聽覺暗示中的凝滯行為要比關聯測試的多。在變更關聯測試中,由于關聯條件箱已被改造得“面目全非”,訓練時動物獲得的對周圍環境的關聯幾乎不存在,因此,凝滯行為應該*少。關聯與變更關聯差別很大,凝滯計分差別越大。
如果動物在第二天的關聯測試和聽覺暗示測試中出現凝滯,而在變更關聯測試中不表現凝滯行為,則可認定:動物的感覺和運動功能均正常;能記住前一天與厭惡刺激配對出現的暗示信號;能分辨前一天不與厭惡刺激配對出現的暗示信號,說明動物具有正常的記憶。這些測試中的任何一項增強或減弱,提示調節記憶情感部分的神經解剖、神經遞質和基因可能發生變化。
場景恐懼實驗注意事項:
1.動物對的反應部分地取決于非條件刺激的強度和痛#。當動物(尤其是基因改變的動物,如轉基因或基因敲除小鼠)不能學會關聯條件反射時,可能是強度不夠或痛#偏高所致。對條件反應程度與強度進行比較分析,可排除對強度因素的疑慮;對刺激電流強度(0.1~0.7mA)與反應作一“量-效曲線”,可評價動物的痛#或對的敏感性。此外,格柵地板若沾有動物的排泄物也可改變電刺激強度。因此,應保持格柵地板的清潔與干燥。
2.由于老年動物聽力減弱甚至喪失,對聽覺暗示可能反應遲鈍或無反應。此外,有些品系的小鼠,即使在成年早期,對高頻音刺激的反應尤其減弱。因此,用這一模型測定老年動物或某些品系的小鼠時應特別謹慎,并避免用高頻音刺激。
3.要使動物在關聯測試中表現凝滯行為,必須讓其在操作箱內有適當的時間。應避免將動物放入箱內便立即給予電刺激,因為這樣動物沒有時間在與箱內環境(關聯)之間形成聯系。
4.觀察者必須快速、準確地判定動物是否表現凝滯行為,而不應在整個10s觀察期間死盯著動物,以免動物在這10s間隙活動而導致計分不準。不同觀察者應用同一種方法計分,兩名觀察者計分之間的相關系數應在0.98以上。同樣地,當采用自動計分系統進行計分時,應對系統進行調節,使之與人工方法計分相比,兩者的相關系數在0.98~1之間。
5.在本實驗中,先測試關聯學習,再測試暗示條件反應。在關聯測試中沒有聽覺暗示刺激,因此,動物在暗示條件測試時對聽覺刺激的反應有可能發生消退(extinction)。理論上,這種聽覺暗示反應可能減弱。為消除這種實驗偏差,將其中一半動物先測試聽覺暗示反應,一小時后再檢查關聯條件反應。
6.實驗分兩天進行。訓練和測試應在每天的同一時間進行。測試(凝滯計分)所花的時間比訓練要長的多,因此,同一批訓練的動物不宜過多。
7.暗示和關聯兩種條件恐懼可表現出發育差異和基因差異。例如,年齡在18天的大鼠有聽覺條件恐懼,但極少有關聯條件恐懼;而到23天時,關聯和聽覺暗示條件恐懼都有。有些品系的小鼠(如DBA/2小鼠)只有很弱的關聯條件恐懼,但聽覺條件恐懼卻很好。
8.對有些基因型動物,如果預先讓其短暫適應關聯條件,關聯學習會得到改善。一般認為這與海馬功能增強有關。這種適應通常在訓練前一天進行,而且時間很短(30~60s)。
9.暗示條件恐懼由側杏仁核調節,而關聯條件恐懼由杏仁核和海馬共同介導。毀損這些腦區可削弱或阻斷暗示與關聯恐懼條件反射
場景恐懼實驗分析系統實驗