產氣莢膜梭菌的生物學特性與檢驗方法！

產氣莢膜梭菌的生物學特性與檢驗方法！

一、行病學

產氣莢膜梭菌為厭氧芽胞菌，是引起食源性胃腸炎常見的病原之一。可引起典型的食物中毒、爆發。由產氣莢膜梭菌引起的疾病為魏氏梭菌中毒。患者臨床特征是劇烈腹絞痛和腹瀉。攝食被本菌污染的食品后8?22小時開始發病。在食品中該菌數量必須達到很高時（1.0×107或更多），才能在腸道中生產毒素，病程通常在24小時內，但某些個體的不顯著癥狀可能會持續1?2周，已報導有少數病人因脫水和其它混合感染而導致死亡。

據美國人類衛生教育福利部報導魏氏梭菌引起的食物中毒，在美國占細菌性食物中毒的30%左右，另據美國疾病控制中心，估計每年因產氣莢膜梭菌引起的食物中毒約近1萬人，其中大約只報導1200例，暴發約20起，大量的暴發和少量的發病都與公共飲食有關。例如：學校的自助食堂和護理病房，產氣莢膜梭菌中毒常發生于兒童和老人。

產氣莢膜梭菌廣泛分布于環境中，經常在人和許多家養及野生動物的腸道中發現該細菌的芽胞*存在于土壤和沉淀物中，從牛肉、豬肉、羔羊、雞、火雞、燜肉、紅燒蔬菜，燉肉和肉汁中分離的產氣莢膜梭菌，引起食物中毒的食品大多是畜禽肉類和魚類食物，牛奶也可因污染而引起中毒，原因是因為食品加熱不*，使芽胞在食品中大量繁殖所致，此外不少熟食品，由于加溫不夠或后污染而在緩慢的冷卻過程中，細菌繁殖體大量繁殖并形成芽胞產生腸毒素，其食品并不一定在色味上發現明顯的變化，人們在誤食了這樣的熟肉或湯菜，就有可能發病。

產氣莢膜梭菌易于形成芽胞，芽胞的熱抵抗力很強，由患者糞便中分離的芽胞能耐受100℃,1?5小時的加熱。除了具有形成芽胞及耐熱等特點之外，生化性狀，毒素及酶的特異性等，同其它魏氏梭菌是一致的。

當產品達到合適溫度時，那些未被殺死的芽胞，由于蒸煮而使其可能發芽。蒸煮后需要經過快速一致的冷卻。事實上在所有暴發的病例中，產氣莢膜梭菌中毒的主要原因是沒有經過恰當冷卻事先煮好的食品，特別當做好的食品量又是很大時，適當的熱處理（60℃以上）充分的再加熱，冷卻食品（低中心溫度為24℃）也是必要的控制措施，培訓食品加工人員，仍是控制措施的一個關鍵方面。

二、生物學特性

1、形態：

本菌菌體兩端鈍圓，直桿狀1-2×2-10μm，革蘭氏陽性，卵圓形芽胞位于菌體*或近端，不比菌體明顯膨大，但有些菌株在一般的培養條件下很難形成芽胞，無鞭毛，在人和動物活體組織內或在含血清的培養基內生長時有可能形成莢膜。

2、培養：

本菌雖屬厭氧性細菌，但對厭氧程度的要求并不太嚴，甚至在EH=200-250mv的環境內也能生長。

在普通培養基上能生長，若加葡萄糖，血液，則生長更好。生長適宜溫度為37-47℃，多認為43-47℃為宜本菌生長和繁殖速度極快，在適宜條件下增代時間僅8min，可利用高溫快速培養法，對本菌進行選擇分離，如在45℃下，每培養3-4小時傳種1次，即可較易獲得純培養，在深層葡萄糖瓊脂中大量產氣，致使瓊脂破碎，在牛奶培養基中，可見到暴裂發酵，在庖肉培養基中培養數小時即可見到生長，產生大量氣體，肉渣或肉塊變為略帶粉色，但不被消化。

在普通瓊脂平板上培養15小時左右可見到菌落，培養24小時菌落直徑2?4mm，呈凸面狀，表面光滑半透明，正圓形，在營養成分不足或瓊脂濃度高的平板上，有時尤其經過傳種的菌株，可能形成鋸齒狀邊緣或帶放射狀條紋的R型菌落。

在含人血、兔血或綿羊血的瓊脂平板上培養的菌落周圍有雙層溶血環，內層溶血*，外層溶血不*，好似靶狀。

在乳糖、牛奶、卵黃瓊脂平板上培養的菌落周圍出現乳光渾濁帶。此反應能被本菌α抗毒素抑制。由于發酵乳糖菌落周圍的培養基顏色發生變化（中性紅指示劑呈粉紅色）不消化牛奶，不分解游離脂肪，菌落周圍不出現透明環及虹彩層。

3、生化特性：

所有菌株均發酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖及蔗糖，產酸產氣，液化明膠，不產生靛基質，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，但也有例外。能將亞硫酸鹽還原為硫化物。在含亞硫酸鹽及鐵鹽的瓊脂中形成黑色菌落。發酵牛奶中的乳糖、牛奶酸凝固，同時由于大量產氣凝塊碎裂，所謂暴力發酵，這是本菌的主要生化特征之一，也是主要鑒別的指標。G+C克分子百分比為24-27%。

產生*酶（磷酸酶C）分解*為磷酰*與非水溶性甘油二酸酯，上述卵黃瓊脂平板菌落周圍出現的乳光渾濁帶即屬本反應。

4、毒素:

(1)、外毒素:各型產氣莢膜梭菌產生的外毒素(或可溶血抗原)共有12種,其中主要有4型,即A、B、C、D.而已知〝A型〞毒素與人類食物中毒有關。

(2)、腸毒素:A型產氣莢膜梭菌的耐熱株能引起人的食物中毒,關于產氣莢膜梭菌食物中毒的發病機制,基本認為是,被耐熱性A型產氣莢膜梭菌芽胞污染的肉、禽等生食品,雖經烹制加熱,但芽胞不僅不死滅,反而由于受到〝熱刺激〞,在較高溫度長時間儲存(即緩時冷卻)的過程中芽胞發芽,生長,繁殖,而且隨食物進入人腸道的這些繁殖體容易再形成芽胞,同時產生腸毒素,聚集于芽胞內,當菌體細胞自溶和芽胞游離時，腸毒素將被釋放出來,人、猴、狗等口服人工提取的該腸毒素能引起腹瀉。

人和動物對產氣莢膜梭菌的毒素的免疫主要表現為抗腸毒素的產生,健康者血清常含有抗腸毒素,似乎表明產氣莢膜梭菌作為正常菌群,在腸道內可能在不斷地產生著腸毒素。

三、檢驗方法

1、樣品的儲存和運送:

如樣品不能立即進行檢驗時,應在樣品中加等量緩沖甘油--lvhuana溶液(液體食品應加雙料的),將樣品做低溫保存,直到檢驗,運送樣品時,應使樣品保持冷凍狀態,并要避免容器消損。

2、將解凍樣品取25g移入滅菌的均質杯,并加入0.1%蛋白胨水225mL,低速攪拌1-2分鐘,使之均質化,作為1:10稀釋液,以上1:10稀釋的均質液,按1mL加入0.1%蛋白胨水9mL,作做成10-2--10-6的系列稀釋液,(如為液體樣品則可吸取25mL加入盛有225mL稀釋劑的500mL稀釋并搖勻,再作10倍遞增稀釋即可)。

傾注不含卵黃的TSC瓊脂倒10個滅菌平皿中,每皿約5mL,并迅速旋轉平皿,使瓊脂凝固后,將每個平皿編號標記,以無菌操作,吸取稀釋樣品1mL分別加到每個瓊脂平板表面中心,再向平皿傾注不含卵黃的TSC瓊脂15mL,緩慢地旋轉平皿,使其與接種物混合均勻.也可用滅菌L棒,將0.1mL樣品稀釋液均勻地涂布于不含卵黃乳液的TSC瓊脂上,將平板水平靜置5-10分鐘,使接種物被吸收,然后用不含卵黃的TSC瓊脂10mL覆蓋平板表層,瓊脂凝固后,將平板置于厭氧罐內于36+1℃,培養20小時,取出平板,用肉眼觀察生長情況和有無黑色菌落,挑選有20-200個黑色菌落的平板進行記數，產氣莢膜梭菌的菌落一般呈黑色。

3、證實:

從可記數的平板(具20-200個菌落)中挑選10個典型菌落,分別接種到液體硫乙醇酸鈉培養基試管中,于36±1℃,培養18-24小時,取培養物涂片,作革蘭氏染色鏡檢,檢查培養物的純度和細菌形態,產氣莢膜梭菌為革蘭氏陽性,粗短的梭狀芽胞桿菌.對于被污染的培養物可劃線接種在含有卵黃的TSC瓊脂平板上,于厭氧條件下以36±1℃,24小時培養,以獲得純培養物。

上述培養物,以接種針穿刺接種動力,硝酸鹽培養基36±1℃厭氧培養24小時觀察有無動力,滴加甲萘胺液和對氨基苯磺酸液各0.5mL,觀察硝酸鹽是否被還原,取生長旺盛的硫乙醇酸鈉培養液1mL接種含鐵牛奶培養基,厭氧培養過夜或46℃2-5小時觀察有無暴烈發酵現象,但培養基不變黑,將培養液點種卵黃瓊脂平板(每個平板至少可點種10點),倒置厭氧培養裝置內36±1℃培養24小時,觀察接種點,產氣莢膜梭菌產生*酶,分解卵黃中的*,使接種點的底部及周圍形成乳白色的渾濁帶.此外還可作明膠液化及含1%水楊甙和含1%棉子糖的發酵試驗等,對上述四項主要生化試驗,全部符合者即可確定為產氣莢膜梭菌。

4、結果解釋及報告:

樣品中產氣莢膜梭菌的計算,基于被證實為產氣莢膜梭菌菌落的百分數(例如10‐4稀釋的平板中,平均有85個菌落,10個菌落中,有8個被證實為產氣莢膜梭菌,那么每1g食品中產氣莢膜梭菌數即為85×(8/10)×10000=680000),報告產氣莢膜梭狀芽胞桿菌數/g(mL) 。

產氣莢膜梭菌檢驗檢測程序

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檢樣25g(mL)或稀釋液225mL

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TSC瓊脂混合傾注

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黑色菌落記數

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任挑黑色菌落10個,分別接種FT培養基

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確證試驗

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鏡 動 銷 牛 卵

檢 力 酸 奶 磷

形 試 鹽 發 脂

態 驗 還 酵 分

　　                  原　　解

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菌落計數

四、培養過程中芽胞形成和腸毒素的產生

假如對分離的菌株,直接測試芽胞和腸毒素,應在硫乙醇酸鹽肉湯中繼續培養,如上述,將儲存培養物移至其它實驗室作測試時,必須先將其移種至Difco公司生產的熟肉培養基中,并于35℃培養24小時,然后再置于室溫中24小時,并將此熟肉培養物放置在4℃保存。

用旋轉混合熟肉培養物,并分別各移種0.5mL至2支含10mL新鮮經殺菌的液體硫乙醇酸鹽培養基中,將其中1管置于有水的燒杯中,或在水浴中加熱75℃10分鐘,于35℃培養18小時,另外1管在35℃培養4小時,并將此培養物接種改良AE芽胞形成培養基中,好用0.75mL經4小時培養的硫乙醇酸鹽的培養基,接種到芽胞肉湯中,于35℃厭氧罐中,培養18-24小時。

核對培養結果,用相差顯微鏡觀察芽胞或作涂片染色鏡檢,顯微鏡視野中少于5個芽胞的認為芽胞形成不良。

將芽胞形成培養物用10000×g轉速15分鐘離心,并將無細胞的芽胞培養物,以反向乳凝試劑盒,檢測腸毒素。

五、控制

適宜的冷卻處理和再加熱，食品加工人員的教育。 當產品達到合適溫度時，那些未被殺死的芽胞可能發芽。蒸煮后需要經過快速統一的冷卻，事實上在所有的爆發病例中，產氣莢膜梭菌中毒的主要原因是沒有經過恰當冷卻事先煮好的食品，特別當食品量又是很大時。適當的熱處理，充分的再加熱，冷卻食品，也是必要的控制措施。食品加工人員的教育仍是控制的一個關鍵方面。

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