動(dòng)物組織細(xì)胞基因組DNA的提取方法！
動(dòng)物組織細(xì)胞基因組DNA的提取方法！
一、儀器及試劑
⒈儀器：
恒溫水浴鍋、臺式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)（GeneQuant）、移液器、玻璃勻漿器、離心管（滅菌）、吸頭（滅菌）
⒉試劑：
（1）細(xì)胞裂解緩沖液：
Tris (pH8.0) 100 mmol/L
EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L
NaCL 20 mmol/L
SDS 10%
胰RNA酶 20ug/ml
（2） 蛋白酶K： 稱取20mg蛋白酶k溶于1ml滅菌的雙蒸水中，?C20℃?zhèn)溆谩?/span>
（3）TE緩沖液（pH 8.0）：高壓滅菌，室溫貯存。
（4）酚：異戊醇（25:24:1）
（5）異丙醇、冷無水乙醇、70%乙醇、滅菌水。
二、操作步驟
⒈取新鮮或冰凍動(dòng)物組織塊0.1g（0.5cm3），盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中，加入1ml的細(xì)胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊，轉(zhuǎn)入1.5ml 離心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min，也可轉(zhuǎn)入37℃水浴12～24h，間歇振蕩離心管數(shù)次。于臺式離心機(jī)以12000 rpm離心5min，取上清液入另一離心管中。
⒉加2倍體積異丙醇，倒轉(zhuǎn)混勻后，可以看見絲狀物，用100ul 吸頭挑出，涼干，用200ul TE 重新溶解。（可進(jìn)行PCR反應(yīng)等，需要進(jìn)一步純化的按下列步驟進(jìn)行）
⒊加等量的酚?異戊醇振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。
⒋取上層溶液至另一管，加入等體積的異戊醇，振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。
⒌取上層溶液至另一管，加入1/2體積的7.5mol/L乙酸氨加入2倍體積的無水乙醇，混勻后室溫沉淀2min ，離心12000 rpm ,10min。
⒍小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。
⒎用1ml 70%乙醇洗滌沉淀物1次，離心12000 rpm ， 5min。
⒏小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉，室溫干燥。
⒐加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存?zhèn)溆谩?/span>
⒑吸取適量樣品于GeneQuant上檢測濃度和純度。
三、常見問題
⒈選擇的實(shí)驗(yàn)材料要新鮮，處理時(shí)間不易過長。
⒉在加入細(xì)胞裂解緩沖液前，細(xì)胞必須均勻分散，以減少DNA團(tuán)塊形成。
⒊提取的DNA不易溶解：不純，含雜質(zhì)較多；加溶解液太少使?jié)舛冗^大。沉淀物太干燥，也將使溶解變得很困難。
⒋電泳檢測時(shí)DNA成涂布狀：操作不慎；污染核酸酶等。
⒌分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不純，含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。在這種情況下，應(yīng)加入SDS至終濃度為0.5%，并重復(fù)步驟2～8。
⒍酚/異戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸?。汉邼舛鹊腄NA，可加大抽提前緩沖液的量或減少所取組織的量。
北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司（biobw）是北京的一家專業(yè)于生物技術(shù)的研究與廣泛運(yùn)用及推廣的高科技公司，位于北京企業(yè)林立的豐臺區(qū)造甲街，生物技術(shù)推廣及運(yùn)用早于2011年開始，成立公司于2013年一月。本公司主要提供色譜耗材、色譜儀器、固相萃取裝置、化學(xué)試劑、樣品瓶、氘燈、標(biāo)準(zhǔn)品、微生物技術(shù)、菌種保藏服務(wù)以及ATCC產(chǎn)品代理等產(chǎn)品及服務(wù)。
