軍團菌的取樣、制樣與檢測方法！

軍團菌的取樣、制樣與檢測方法！

本標準描述了一種用于軍團菌分離和估計環境樣品中軍團菌數量的培養方法。

該方法適用于所有環境樣本，包括飲用水、工業用水和天然水以及沉淀物、沉積物和粘土/軟泥等相關樣本。

一、培養基和試劑

GVPC培養基、BCYE培養基(也可用硝酸鐵瓊脂代替)、酸處理緩沖液、BCYE-Cys(不含L-半*)

二、取樣

1、取樣容器

水樣可采用玻璃、聚乙烯或類似容器。以前用過的容器應該清洗干凈、扣干水分，121℃高壓滅菌15min。如果容器不能經受高壓滅菌，應在高于70℃的流動熱水或流動蒸汽中處理至少5min。

2、含生物防腐劑的樣品

如果水樣中含有或被認為含有氧化型生物防腐劑，應在取樣時或取樣前加入非活性試劑加以中和。如果水樣中含有消毒劑，需在采樣前或采樣后加入中和劑，含氯或氧化型消毒劑可用*或硫代硫酸鉀作中和劑。

原則上講，實驗室接到水樣后應盡快進行微生物學分析，是取樣當天，尤其對于已知含生物防腐劑的樣品。因此，建議從樣品采集到制備好濃縮樣的間隔為2d，不應超過5d，長不超過14d。

3、樣品運輸

樣品應在6-18℃條件下被運輸，應避免熱和光照，在1d內，不超過2d將樣品送到實驗室。

三、制樣

如果液體樣品軍團菌的數量估計超過105CFU/L，可以采用直接平板法，即直接涂布于GVPC平板。為了確保低于這個數量樣品中軍團菌的檢測，需采用濃縮技術。為了濃縮水樣，可采用膜過濾法或離心法。

1、膜過濾法

如果樣品是渾濁的、乳濁的或有顏色的，應采用離心法。

采用膜過濾裝置進行膜過濾，采用直徑47-147mm，孔徑0.22μm和0.45μm的膜。過濾后的膜應放置在帶蓋的無菌容器中，可用無菌剪刀剪碎，加5ml-25ml的無菌稀釋液或無菌去離子水，不斷搖動至少2min。也可將容器放入超聲波中2-10min。

2、離心法

取200ml樣品于300-500ml容積的離心瓶中，6000g離心10min或3000g離心30min，保持溫度在15-25℃，棄去上清液，將沉淀物懸浮在2-20ml無菌稀釋液或無菌去離子水中。

四、培養

1、將制備好的樣品（濃縮的或未濃縮的）

分成3份，1份不做任何處理；1份進行熱處理；1份進行酸處理。

2、熱處理

加1±0.5ml樣品于一無菌容器中，50±1℃水浴處理30±2min。

3、酸處理

加1-10ml樣品于一擰蓋的容器中，6000g離心10min或3000g離心30min，用無菌槍頭吸去一半體積的上清液，通過渦旋重新懸浮剩余物，用酸處理緩沖液補足原始體積。混合靜置5±0.5min。

4、選擇性培養基的接種

分別接種未處理、熱處理和酸處理的樣品0.1-0.5ml于GVPC培養基上，熱處理和酸處理的樣品應在處理完立即接種，記錄接種體積。

5、培養

翻轉平板，36±1℃培養10d。

6、檢查平板

在10d的培養期間，用顯微鏡在2-4d內至少觀察3次，軍團菌生長較慢，很可能被其他菌掩蓋，記錄每一種菌落形態的數量。

注：軍團菌的菌落通常是白-灰-藍-紫，但也可能出現棕色、粉色、灰綠色或深紅色。軍團菌表面光滑，邊緣整齊，出現典型的毛玻璃現象。在紫外光下， L.bozemanii, L.gormanii, L.dumoffii, L.anisa, L.cherrii, L.steigerwaltii, L.gratiana, L.tucsonensis和L.parisiensis有亮白色熒光；L.rubrilucens 和L.erythra呈現紅色；L.pneumophila菌落呈現暗綠色通常伴隨有黃色。熒光的顏色有助于區分樣品中軍團菌的不同種。為了避免軍團菌的死亡，不能將平板長時間暴露在紫外燈下。

五、可疑軍團菌的確證

1、BCYE和其他培養基的二次培養

從每個GVPC平板上至少選擇3個可疑軍團菌菌落接種到BCYE和BCYE-Cys兩塊平板上進行二次培養，36±1℃培養至少2d。在BCYE上生長而在BCYE-Cys上不生長的被認為是軍團菌。通過血清學實驗（6.2）確證在BCYE上生長而在BCYE-Cys上不生長的菌落。

2、PCR及其相關技術：優點：有著更高的靈敏度和特異性，缺點：非特異性擴增 及交叉污染。

3、直接免疫熒光抗體法（DFA）：優點是簡便、快速，缺點是敏感性低，且只能用于Lp的檢測。

注：血瓊脂和營養瓊脂可以代替BCYE-Cys培養基。

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