（貨號(hào)：WLRN5002）
原理概述：
本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)：在常溫恒溫下，特殊修飾的反轉(zhuǎn)錄酶利用特異性引物和模板RNA合成cDNA鏈，反應(yīng)體系中的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA鏈為模板進(jìn)行快速核酸擴(kuò)增反應(yīng)。依賴nfo酶的作用，加入根據(jù)模板設(shè)計(jì)的特異的分子探針，使用膠體金技術(shù)（三明治夾心法）可以對(duì)最終結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。
引物設(shè)計(jì)：
建議使用長度在 30-35 bp的引物，引物過短會(huì)影響擴(kuò)增速度和檢測(cè)靈敏度；下游引物的5’端標(biāo)記一個(gè)修飾基團(tuán)（常用）。引物設(shè)計(jì)避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)而影響擴(kuò)增；擴(kuò)增子長度建議在150-300 bp，通常不超過500 bp。
探針設(shè)計(jì)：
探針序列不與特異性引物識(shí)別位點(diǎn)重疊，長度為46-52 nt，序列避免回文序列、內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)和連續(xù)的重復(fù)堿基。探針共有三個(gè)修飾位點(diǎn)：5’端修飾一個(gè)抗原標(biāo)記（典型FAM）;在5’端和3’末端的中部位置標(biāo)記一個(gè)dSpacer（四氫呋喃，THF），作為nfo的識(shí)別位點(diǎn)；3’末端標(biāo)記一個(gè)修飾基團(tuán)，例如胺基、磷酸基團(tuán)或C3-Spacer等。
試劑盒組成：
100T/盒
| 組成 | 含量 |
| C buffer | 1 mL×2管 |
| L buffer | 500 μL×1管 |
| PR-core | 1.2 mL×1管 |
| N-core | 60 μL×1管 |
| B buffer | 300 μL×1管 |
| 使用說明書 | 1份 |
試劑盒儲(chǔ)存：
運(yùn)輸條件：低溫運(yùn)輸；
儲(chǔ)存條件：儲(chǔ)存溫度 ≤ -20 oC，避光保存，避免重壓、反復(fù)凍融；
產(chǎn)品有效期：6個(gè)月
操作步驟：提前將試劑盒所需組分取出，冰上或低溫下融化（C buffer可室溫融化），震蕩混勻。
1) 向無菌0.2mL PCR管中加入20 μL C buffer、5 μL L buffer；
2) 加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探針，再加入1.5μL dNTPs(10 mM)；
3) 向反應(yīng)管中加入12 μL PR-core和0.6 μL N-core，（步驟1~3可以混合后再分裝至反應(yīng)管中）；
4) 向反應(yīng)管中加入3.8 μL核酸模板；
5) 最后向反應(yīng)管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（請(qǐng)務(wù)必上下顛倒甩動(dòng)反應(yīng)管8-10次進(jìn)行混勻；對(duì)于多個(gè)反應(yīng)，建議提前將B buffer加至反應(yīng)管的蓋子內(nèi)側(cè)，蓋上蓋后上下顛倒后混勻）；混勻后，將反應(yīng)液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應(yīng)管放入恒溫設(shè)備中42 oC孵育8-12 min；
6) 反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL加入含有190 μL ddH2O的離心管中，混合均勻后，將膠體金試紙條的樣品端插入離心管中平衡，5 min內(nèi)觀察質(zhì)控線與檢測(cè)線判讀結(jié)果。
體系配制
| 組分 | 體積（μL） |
| C buffer | 20
5 |
| L buffer | |
| PR-core | 12 |
| N-core | 0.6 |
| dNTPs(10 mM) | 1.5 |
| 上游引物(10 μM) | 2 |
| 下游引物(10 μM) | 2 |
| 探針(10 μM) | 0.6 |
| DNA模板 | 3.8 |
| B buffer | 2.5 |
| 總體積 | 50 |
| N：陰性對(duì)照； P：正對(duì)照 |
注意事項(xiàng)：
- 為保證液體試劑組分活性，請(qǐng)保證儲(chǔ)存溫度 ≤ -20 oC；試劑使用時(shí)請(qǐng)保持低溫，避免高溫放置過長時(shí)間；
- 在進(jìn)行反應(yīng)時(shí)請(qǐng)注意避免微量核酸染，并設(shè)置空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)組。
