【儀表網 行業標準】中國材料與試驗標準化委員會科學試驗標準化領域委員會科學試驗裝置標準化技術委員會(CSTM/FC98/TCO3)歸口承擔的《小分子有機化合物內標法定量分析核磁共振氫譜法》團體標準(立項號:CSTM LX 9803 01135——2022)已完成征求意見稿，按照《中關村材料試驗技術聯盟團體標準管理辦法》的有關規定，現公開廣泛征求意見。
 

　　核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance, NMR)波譜法是一種基于特定原子核性質的分析方法，它通過原子核在特定外磁場中吸收與其裂分能級間能量差相對應的射頻場能量而產生共振信號。核磁共振現象自1945年被發現以來，廣泛應用于有機化合物的分子結構、分子間的相互作用和分子動力學研究等，近些年來逐漸應用于定量研究。定量核磁共振(quantitative Nuclear Magnetic Resonance, qNMR)具有許多優點，它是一種直接分析法，測定過程中不會破壞待測樣品結構或組分，通用性強，分析時間短，其最大的優點是其用于含量測定時，不需要獲取目標化合物的自身標準物質。色譜法在含量測定中的優點是其具有高靈敏度和高專屬性，但缺點是需要自身標準物質，獲取自身標準物質需要耗費大量的時間和資金，有時即使投入成本很多，也難以獲得，而核磁共振氫譜法正好可以克服這個缺點。
 

　　盡管理論上任何能產生核磁共振信號的原子核都能做定量研究，但由于受原子核自身特性如磁旋比、天然豐度等影響，導致各原子核的核磁共振譜圖的分辨率和靈敏度差異較大。而定量核磁共振對檢測譜圖分辨率及靈敏度要求較高，且氫核的靈敏度和天然豐度較高。故在實際應用中，氫譜定量核磁共振(quantitative Proton Nuclear Magnetic Resonance, 1H qNMR)的使用較為廣泛。
 

　　核磁共振氫譜定量法有相對定量和絕對定量兩種方式。相對定量是基于待測樣品中每個組分特征峰的積分面積，檢測特定組分間的相對含量。一般應用于測定樣品中雜質的相對含量，或者混合物中各成分相對含量。絕對定量是采用標準物質，通過比較樣品的特征峰面積與內標峰的峰面積計算樣品的含量。絕對定量在使用時有內標法和外標法，一般而言，內標法的準確性優于外標法，目前國際上的相關標準中推薦采用的也是內標法。
 

　　在核磁共振用于小分子有機化合物的定性研究時，有比較成熟完善的管理規范和指導原則，如教育部制定的《超導脈沖傅里葉變換核磁共振方法通則 JY/T 0578-2020》等，而在用于定量研究時，其對儀器設備、實驗參數、待測物特性以及人員操作等要求偏高，與之相關的管理規范尤其是實際應用方面的指導原則比較少，極大地限制了定量核磁共振的發展。但是目前核磁共振定量檢測和分析領域缺乏統一的標準和規范，極大的限制了定量核磁技術的應用發展。因此，為推動核磁共振氫譜定量分析法在分析檢測、含量測定等方面的應用，滿足該技術在科研和相關行業研發的需求，制定我國核磁共振氫譜內標法定量分析的操作標準勢在必行。
 

　　本文件為首次發布。本標準適用于小分子有機化合物(分子量≤900)的絕對定量中的內標法而擬定的，因此，本文件適用于核磁共振氫譜的內標法定量分析。
 

　　實驗采集：
 

　　1.弛豫延遲時間D1 根據待測樣品和內標物特征峰的縱向弛豫時間T1 來設置弛豫等待時間D1，D1 的設置應大于 5 倍T1，當D1 設置為 7 倍的T1 時間時，99.9%可以獲得弛豫，當D1 設置為 5 倍的T1 時間時，99.3%可以獲得弛豫，這意味著 7 倍T1 的等待時間可以將誤差從 0.7%降低到 0.1%，這對于整個準確度要求控制在 1.0%內時非常重要。在有機化合物中，一般質子的弛豫時間都小于 10s，只有一些小分子例外，如甲酸鈣和某些對稱性非常高的分子，需要注意的是這些化合物由于特征峰明顯，經常被選為內標物，這時候實驗時間會增長。弛豫延遲時間D1，脈寬的長度和采集時間構成了每次采集的重復時間，只要整個的重復時間達到 70s，即可達到 99.9%的弛豫，達到所需的準確性，因此，D1 設置為 63s較為適宜。
 

　　2.激發角度 采用 90°角激發。與常規氫譜采集時一般采用 30°角激發相比，90°角激發可以獲得其兩倍的信噪比(要獲同樣的信噪比，若用 30°角激發的話，掃描次數要翻 4 倍)。完全弛豫一般要求D1 等待時間是特征峰和內標物峰質子中較長弛豫時間的 7 倍，而 30°角激發，D1 等待時間僅能縮短到 6 倍的特征峰和內標物峰質子中較長弛豫時間。因此，90°角激發是更好的選擇。
 

　　3.采集時間 采集時間 5-8s足夠，一般采用 7s。采集時間由采樣點數和譜寬決定。采集時間需要足夠的長，能夠覆蓋完整的FID信號，但也并不是越長越好，若自由感應衰減信號消失后，采集到的僅是噪音信號。
 

　　4.掃描次數 采集次數是根據所選擇的特征峰要求的信噪比來決定，信噪比需要達到 150：1 以上，而信噪比對核磁積分的準確度有非常重要的影響。信噪比對積分的影響用相對標準偏差來估算(公式RSD=86/SN)，若信噪比為 86，那么對積分帶來的不確定度為 1%。信噪比與采集次數的平方根成正比，這意味著若要得到翻倍的信噪比，需要 4 倍的采集時間來獲得。
 

　　5.發射中心 發射中心應設置在待測物的特征峰和內標物的特征峰的中間，避免由于未能均勻激發造成的偏差。
 

　　處理和處理參數：
 

　　1.零填充 零填充可以增加積分的準確性，將處理參數中的 SI 設置為采集參數中的 TD 若干倍數即可，如設置 SI=2*TD 可以滿足要求。
 

　　2.窗函數 如果由于樣品量不夠或者采集時間過長造成信噪比過低，可以通過添加窗函數 LB(0.2~1 Hz)來提高信噪比，如將氫譜的窗函數 LB 設置為 0.3。值得注意的是，添加窗函數會導致圖譜的分辨率降低。
 

　　3.相位調整 相位調整可以采用自動相位調整，若自動相位調整未達到預期目的，可以采用手動相位調整。
 

　　4.基線校正 基線校正可以采用自動基線校正，若自動基線校正未達到預期目的，可以采用手動校正。
 

　　5.積分 為保證 99%的峰面積的準確積分，積分區域應至少保證為半峰寬的 20 倍，如果這個區域范圍出現峰的重疊，可以適當縮窄這個范圍，但是必須同時對目標化合物和內標物的特征峰范圍進行縮窄。
 

　　此外，如果 13C 的衛星峰出現，對目標化合物和內標物的特征峰進行積分時，要么同時包含衛星峰，要么同時都不含衛星峰。若峰重疊無法用改變溶劑或者其他手段實現，這時可以采用峰去卷積的辦法。
 

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