PCR檢測試劑盒使用說明

1：樣品準備：取1毫升細胞培養上清(貼壁和懸浮細胞都可以，已培養48小時以上)，在16000g離心5分鐘，小心棄去上清，避免丟失沉淀(沉淀量有可能很少，目視看不到)。將沉淀用無菌PBS重懸，在16000g離心5分鐘，同樣小心棄去上清，如此反復用無菌PBS洗三次。后將獲得的沉淀用100微升超純水重懸，置于100℃水浴中孵育5分鐘。如此制備好的樣品可在4℃保存1到2個月。

2：PCR反應的準備：

待各組份融化后先瞬時離心，然后輕彈混勻。按下表在已滅菌的PCR管中配制反應體系，每次實驗需加一個陰性和一個陽性對照，測試反應管可以有多個。配制過程中應注意無菌，并注意避免操作產生的氣溶膠造成樣品間的交叉污染，推薦在有風壓的設備如超凈臺或生物安全柜中進行操作。建議配制完畢后瞬時離心以使液體沉至管底。

3：PCR反應：

降落PCR法(Touchdown PCR)：94℃變性2分鐘;首循環：94℃變性30秒，68℃退火30秒，72℃延伸45秒;從第二到八個循環開始，每循環退火溫度下降1℃，其余不變;從第九個循環開始，反應條件固定為：94℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸45秒，循環32次;循環結束后，在72℃延伸7分鐘，后保持在4℃。

4：瓊脂糖凝膠電泳：

按常規方法準備好2%瓊脂糖凝膠，加入EB或Gold-View等用于顯色。每份反應液取8微升，無須加入上樣緩沖液，直接加入凝膠加樣孔中，另留一孔加入DNA marker(要求在400-700bp區間有顯示條帶)，120伏電泳約30分鐘。在紫外線下觀察電泳結果，陽性對照應在643bp處有一條帶，陰性對照無條帶，檢測條帶在438-470bp區間。

PCR檢測試劑盒注意事項

1：組份A中含有染料，染料的加入不影響PCR反應，反應產物可直接電泳，節省時間。

2：本試劑盒檢測范圍涵蓋支原體所有種屬，真核細胞和革蘭氏陰性菌不會造成干擾，與支原體親緣關系較近的革蘭氏陽性菌在反應中的靈敏度較支原體低1000-10000倍。

3：本試劑盒適用于檢測支原體感染，客戶如需區分感染的種屬，可將PCR產物切膠然后測序，進行序列比對即可知種屬類型。

4：有時可直接用細胞培養上清進行PCR反應。培養上清中常含有高濃度的PCR抑制劑，可能導致假陰性結果，故不建議使用此法。有些PCR抑制劑用離心可以除去，若離心不能去除，則推薦抽提基因組DNA進行PCR。而某些PCR抑制劑，如黑色素，通過抽提基因組DNA也不能去除，此時可以通過加入高濃度(如2%)的BSA(牛血清白蛋白)中和其抑制活性。

5：假陰性結果判斷方法：在測試反應管中同時加入測試樣品和陽性對照樣品，觀察對照條帶是否出現。在陽性對照管出現對照條帶的情況下，如果測試反應管的對照條帶和檢測條帶都沒有出現，則可判斷為PCR反應受到了抑制，即假陰性結果。陽性對照管如果沒有出現對照條帶，請檢查PCR條件是否恰當，或者與技術支持聯系。

6：每個測試樣品建議做兩個反應：一個與陽性對照樣品共同反應，排除假陰性結果，另一個單獨反應，可避免因加入陽性對照樣品所致的靈敏度降低。如果測試樣品中支原體含量很高，可能會抑制陽性對照條帶的出現。