免疫熒光染色試劑盒(Immunol Fluorence Staining Kit)系列是Elabscience®開發(fā)的用于細(xì)胞或組織切片檢測(cè)免疫熒光染色的試劑盒。在有適當(dāng)?shù)囊豢箼z測(cè)特定的目標(biāo)蛋白時(shí)，就可以使用免疫熒光染色試劑盒檢測(cè)到紅色、綠色或藍(lán)色等熒光。

推薦Elabscience®的免疫熒光染色的試劑盒。

操作步驟：

1. 免疫熒光染色的準(zhǔn)備工作

A.固定液的準(zhǔn)備：

推薦使用4%多聚甲醛作為固定液(E-IR-R113)，或根據(jù)特定的一抗或樣品采用有效成分為乙醇、甲醇或其它類型的固定液。

B.TBST工作液的準(zhǔn)備：

推薦使用TBST作為洗滌液，可使用Elabscience®的10×TBST(E-BC-R335)，按照1:9的比例用去離子水稀釋至1×的TBST工作液。

C.一抗稀釋液的準(zhǔn)備：

推薦使用Elabscience®的抗體稀釋液(E-IR-R106)，也可選用PBS作為一抗稀釋液。

D.一抗的稀釋：

按照一抗說明書中推薦的用于免疫熒光染色的稀釋比例用一抗稀釋液稀釋一抗。

E.熒光標(biāo)記二抗的稀釋：

推薦使用Elabscience®的抗體稀釋液(E-IR-R106)，按照1:50的比例用將試劑盒中的免疫熒光染色二抗稀釋成工作液，也可選用PBS作為抗體稀釋液。根據(jù)熒光的強(qiáng)弱，稀釋的比例可以適當(dāng)提高或降低。

2. 對(duì)于貼壁細(xì)胞

A.  取普通潔凈蓋玻片于70%乙醇中浸泡5分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，無菌超凈臺(tái)內(nèi)吹干或用細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)PBS或0.9%NaCl等溶液洗滌三遍，再用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌一遍。將蓋玻片置于六孔板內(nèi)，種入細(xì)胞培養(yǎng)過夜，使約為50%-80%滿。

B.  按照特定的實(shí)驗(yàn)?zāi)康奶幚砑?xì)胞后，吸盡培養(yǎng)液，加入1 ml固定液，固定10分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間(可4°C固定過夜)。

C.  去固定液，用TBST工作液洗3次，每次3~5分鐘，吸盡液體。洗滌時(shí)宜用搖床，或手動(dòng)晃動(dòng)數(shù)次。

D.  用試劑盒中的正常山羊血清封閉液(E-IR-R110)封閉30分鐘，可以在搖床上輕輕搖動(dòng)。

E.  去除封閉液，用稀釋的特定一抗?jié)窈袃?nèi)37°C避光孵育60分鐘，可以在搖床上輕輕搖動(dòng)。為增強(qiáng)與一抗的結(jié)合，可以4°C孵育過夜。

F.  去除一抗，用TBST工作液洗滌3~5次，每次3~5分鐘。每次洗滌時(shí)都可以在搖床上輕輕搖動(dòng)。

G.  去除TBST工作液，加入100 μL稀釋好的熒光標(biāo)記的二抗?jié)窈袃?nèi)37°C避光孵育60分鐘。

H.  TBST工作液洗滌3~5次，每次3~5分鐘，期間適當(dāng)注意避光操作。

I.   復(fù)染核：滴加試劑盒中的DAPI染色液(E-IR-R103)避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，TBST工作液洗滌玻片5分鐘，洗滌4次去除多余的DAPI染色液。

J.   滴一滴試劑盒提供的抗熒光淬滅封片液(E-IR-R119)于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，盡量避免氣泡。使細(xì)胞接觸封片液，切勿弄反。

K.   如果一抗選用適當(dāng)，在熒光顯微鏡下可以觀察到熒光。

3. 對(duì)于懸浮細(xì)胞

A.   離心收集細(xì)胞樣品于1.5 ml離心管內(nèi)，吸除上清后輕輕彈散細(xì)胞。

B.   加入0.5 ml固定液，緩緩懸起細(xì)胞，固定10分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間(可4°C過夜)。

C.   離心去固定液，用TBST工作液洗3次，每次3~5分鐘。洗滌期間可以用手或搖床輕輕晃動(dòng)。

D.   最后一次離心后吸去大部分液體保留約50 μL液體，再緩緩懸起細(xì)胞，滴加至載玻片上，盡量使細(xì)胞分布均勻。

E.   稍晾干，使細(xì)胞貼在載玻片上不易隨液體流動(dòng)。如果條件許可，可以使用適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)，通過離心把細(xì)胞貼緊在載玻片上。

F.   用試劑盒中的正常山羊血清封閉液(E-IR-R110)封閉30分鐘。

G.   去封閉液，用稀釋的特定一抗?jié)窈袃?nèi)37°C避光孵育60分鐘。為增強(qiáng)與一抗的結(jié)合，可以4°C孵育過夜。

H.   去除一抗，用TBST工作液洗滌3~5次，每次3~5分鐘。

I.    去除TBST工作液，加入100 μL稀釋好的熒光標(biāo)記的二抗?jié)窈袃?nèi)37°C避光孵育60分鐘。

J.    TBST工作液洗滌3~5次，每次3~5分鐘，期間適當(dāng)注意避光操作。

K.   復(fù)染核：滴加試劑盒中的DAPI染色液(E-IR-R103)避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，TBST工作液洗滌玻片5分鐘，洗滌4次去除多余的DAPI染色液。

L.    滴一滴試劑盒提供的抗熒光淬滅封片液(E-IR-R119)于載玻片上，蓋上蓋玻片，盡量避免氣泡。

M.   如果一抗選用適當(dāng)，在熒光顯微鏡下可以觀察到熒光。

4. 對(duì)于組織切片

A.   對(duì)于石蠟切片，需先完成脫蠟、水化和抗原修復(fù)。對(duì)于冰凍切片可以直接按照下面的步驟操作。

B.   用固定液固定10分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間(可4°C過夜)。

C.   去固定液，用TBST工作液洗3次，每次3~5分鐘，吸盡液體。洗滌時(shí)宜用搖床，或手動(dòng)晃動(dòng)數(shù)次。

D.   用試劑盒中的正常山羊血清封閉液(E-IR-R110)封閉30分鐘，可以在搖床上輕輕搖動(dòng)。

E.   去除封閉液，用稀釋的特定一抗?jié)窈袃?nèi)37°C孵育60分鐘，可以在搖床上輕輕搖動(dòng)。為增強(qiáng)與一抗的結(jié)合，可以4°C作用過夜。

F.   去除一抗，用TBST工作液洗滌3~5次，每次3~5分鐘。每次洗滌時(shí)都可以在搖床上輕輕搖動(dòng)。

G.   去除TBST工作液，加入100 μL稀釋好的熒光標(biāo)記的二抗?jié)窈袃?nèi)37°C避光孵育60分鐘。

H.   TBST工作液洗滌3~5次，每次3~5分鐘，期間適當(dāng)注意避光操作。每次洗滌時(shí)都可以在搖床上輕輕搖動(dòng)。

I.    復(fù)染核：滴加試劑盒中的DAPI染色液(E-IR-R103)避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，TBST工作液洗滌玻片5分鐘，洗滌4次去除多余的DAPI染色液。

J. 滴一滴試劑盒提供的抗熒光淬滅封片液(E-IR-R119)于載玻片上，蓋上蓋玻片，盡量避免氣泡。

K.   如果一抗選用適當(dāng)，在熒光顯微鏡下可以觀察到熒光。