夾心 ELISA 測定兩層抗體（捕獲抗體和檢測抗體）之間的抗原。目標抗原必須包含至少兩個能夠結合到抗體的抗原表位。單克隆或多克隆抗體均可在夾心 ELISA 系統中用作捕獲抗體和檢測抗體。單克隆抗體識別單一表位，可對抗原中微小差別進行定量檢測。多克隆抗體通常用作捕獲抗體以沉降盡可能多的抗原。夾心 ELISA 省去了分析之前的樣品純化步驟，而且提高了分析靈敏度（靈敏度比直接或間接 ELISA 高 2-5 倍）。

封閉和加樣過程：

1.       每孔添加 200 μL 封閉緩沖液（5% 脫脂奶粉/PBS），封閉包被孔中剩余的蛋白質結合位點。

2.       用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育至少 1-2 小時，或在 4 ℃ 下孵育過夜。

3.       用 200 µL PBS 洗滌微量滴定板兩次。

4.       每孔添加 100 μL 經過稀釋的樣品。通常將未知樣品的信號與標準曲線的信號進行比較。每個板都必須測定標準品（兩重測定或三重測定）和空白樣。在 37 ℃ 下孵育 90 分鐘。
確保標準品的濃度涵蓋抗體結合的大部分動態檢測范圍。可能需要優化濃度范圍以確保獲得合適的標準曲線。樣品和標準品通常采取兩重測定或三重測定。

5.       棄去樣品，用 200 μL PBS 洗滌微量滴定板兩次。