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細胞凍存及復蘇操作步驟:
一、凍存
1、消化細胞,將細胞懸液收集至離心管中。
2、1000rpm離心10分鐘,棄上清液。
3、沉淀加含保護液的培養,計數,調整至5×106/ml左右。
4、將懸液分至凍存管中,每管1 ml。
5、將凍存管口封嚴。如用安瓿瓶則火焰封口,封口要嚴,否則復蘇時易出現爆裂。
6、貼上標簽,寫明細胞種類,凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細繩。
7、按下列順序降溫:室溫→4℃(20分鐘)→冰箱冷凍室(30分鐘)→低溫冰箱(-30℃ 1小時)→氣態氮(30分鐘)→液氮。
注意:操作時應小心,以免液氮**。液氮定期檢查,隨時補充,不能揮發干凈,一般30立升的液氮能用1~1.5月。
二、復蘇
1、準備一個茶缸或1000ml的燒壞,內裝2/3杯37℃的溫水。
2、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內融化。
3、打開凍存管,將細胞懸液吸到離心管中。
4、1000rpm離心10分鐘,棄去上清液。
5、沉淀加10ml培養液,吹打均勻,再離心10分鐘,棄上清液。
6、加適當培養基后將細胞轉移至培養瓶中,37℃培養,**天觀察生長情況。
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