免疫熒光(IF)是一種用于可視化觀察細胞內過程、狀態和結構的強大工具。 IF制劑可通過多種顯微鏡技術（如激光共聚焦、寬場熒光、全內反射成像、基態淬滅顯微成像等）來加以分析，具體取決于應用目的或研究人員的關注重點。 與此同時，在很多使用至少一套簡易熒光顯微鏡的研究工作組當中，IF早已成為的一部分。
其次是熒光色素，與免疫復合物耦合，因此可以用顯微鏡觀察目標結構。
標準IF流程
IF實驗所需時間：約5個小時。
這是一種蓋玻片上通過化學交聯劑進行固定的培育細胞接受間接IF檢查的標準方案。
· 濕盒非常適合IF實驗，并且可以輕松完成自制（見幻燈片“如何制備濕盒”）。該處理可防止試劑干燥并允許在黑暗中進行培養，這對于處理熒光色素很重要，并且對于已經存在的熒光蛋白是必要的。
· 試劑用量的選擇要確保蓋玻片能夠濕潤。確保樣本不會干燥。
· 所有培育步驟都在室溫下完成。
1. 清洗細胞兩次并使用鑷子小心地將帶有向上翻轉細胞的蓋玻片放入濕盒。
2. 使用4% 福爾馬林進行10分鐘的固定并清洗3次。
3. 使用0.1% TX-100/PBS進行15-20分鐘的透化處理并清洗3次。
4. 使用5%正常山羊血清/PBS或1% BSA/PBS進行45分鐘的封閉（無需清洗）。
5. 在封閉溶液內稀釋一抗并使用2小時（或在4℃下連夜使用）。清洗4次將未結合的一抗清除掉。
6. 使用二抗進行1個小時的孵育，在封閉溶液或清洗緩沖液內進行稀釋。
7. 吸取二抗，如有需要可使用Hoechst或DAPI [1 μg/ML]在PBS當中孵育10分鐘。清洗4次，即便此時還沒有出現細胞核染色。
8. 用鑷子輕輕取出蓋玻片并將其進入H2O內，清除掉清洗緩沖液的殘留鹽分。
9. 在顯微鏡載玻片上滴一滴封固溶液并將蓋玻片與細胞倒置這滴溶液上。用鑷子輕輕按壓試樣，使封固介質均勻分布而不會擠壓樣本。
10.固化后就準備好進行顯微鏡觀察了。
配方
清洗緩沖液
· 1 × PBS（磷酸鹽生理鹽水緩沖液）
1. 137 mM：NaCI
2. 2.7 mM：KCI
3. 10mM：Na2HPO4
4. 1.8 mM：KH2PO4
· 使用HCI將pH值調節到7.2-7.4
· 如為PBS++，需添加最終濃度為1 mM的CaCl2和MgCl2
· 如為PBS-T，需添加最終濃度為0.05%的Tween 20
固定緩沖液
· 福爾馬林：
1. 將4% PFA（多聚甲醛）溶解于溫暖（50-70℃）的dH2O當中，pH值8（使用NaOH進行調節）。
2. 將10 × PBS添加到最終濃度為1 × PBS的溶液當中（如100 mL 10 × PBS溶于900 mL 4% PFA/dH2O）。
3. 使用HCI將pH值調節到7.2-7.4。
· 甲醇（預先冷凍至-20℃）：
1. 99%甲醇（-20℃）
· 甲醇/丙酮（預先冷凍至 -20℃）：
1. 50%甲醇（-20℃）和50 %丙酮（-20℃）
透化緩沖液
· TX-100（Triton X-100)：
1. PBS，最終濃度0.1% TX-100
· 皂甙：
1. PBS，最終濃度0.1%的皂甙
· 其他清潔劑可在PBS當中以相同濃度進行使用。
封閉緩沖液
· BSA（牛血清蛋白）：
1. PBS，最終濃度為1% BSA
· 奶粉：
1. PBS，最終濃度為1%奶粉
· 正常血清：
1. PBS，最終濃度為5%正常血清
細胞核染料
· Hoechst或DAPI：
1. 在PBS中制備Hoechst 33342或DAPI溶液，最終工作濃度為1 μg/mL。
