丙型肝炎病毒(HCV)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)反應流程常規程序:

將PCR反應所需的成分配置完后，在PCR儀上于94-96℃預加熱幾十秒至幾分鐘，使模板DNA充分變性，然后進入擴增循環。在每一個循環中，先于94℃保持30秒鐘使模板變性，然后將溫度降到復性溫度（一般50-60℃之間），一般保持30秒鐘，使引物與模板充分退火；在72℃保持1分鐘（擴增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一個循環。重復這樣的循環25～35次，使擴增的DNA段大量累積。最后，在72℃保持3-7min，使產物延伸完整，4℃保存。

2．復性（退火）和延伸溫度

復性的溫度是PCR擴增是否順利的關鍵因素，通常在50-60℃之間。具體的溫度主要由引物的Tm值決定。延伸溫度絕大多數設定為72℃。如果復性的溫度很高，可以將延伸溫度和復性溫度設置成同一溫度，變成二步法PCR。

3．反應時間

變性步驟一般使用30秒鐘，如果模板的G+C含量較高，或直接用細胞做模板，變性時間可適當延長。復性時間有30秒種一般是足夠的。延伸時間由擴增產物的大小決定，一般采用1kb用1分鐘來保證充足的時間。

4．循環次數

循環次數主要與模板的起始數量有關，在模板拷貝數為104～105數量級時，循環數通常為25～35次。

平臺效應（plateaueffect）：PCR擴增過程后期會出現的產物的積累按減弱的指數速率增長的現象。原因：底物和引物的濃度已經降低，dNTP和DNA聚合酶的穩定性或活性降低，產生的焦磷酸會出現末端產物抑制作用，非特異性產物或引物的二聚體出現非特異性競爭作用，擴增產物自身復性，高濃度擴增產物變性不*。

5．PCR反應液的配制

PCR反應體系的配置方式有時也會影響反應的正常進行。常規方法與其它酶學反應一樣，在最后加入DNA聚合酶。早期的PCR儀沒有帶加熱的蓋子，要求在反應液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發。

對于使用具3’-5’外切活性的高溫DNA聚合酶時，有時會擴增不出產物。在遇到這個問題時，如果將反應成分分開配制，A管含模板、引物和dNTP，以及調整體積的H2O，B管含緩沖液、DNA聚合酶和水，然后再將兩管溶液混合起來，可較好地克服這個問題。

按照常規的方法配制反應體系，有時會出現非特異性擴增的問題。熱啟動（hotstart）PCR操作方式可較好解決這一問題。將dNTP、緩沖液，Mg2+和primer先配制好，然后加入一粒蠟珠（如AmpliWaxPCRQam100），加熱熔化，再冷卻，使蠟將溶液封住，最后加入模板和DNA聚合酶等剩余成分。只有當PCR反應進入高溫階段后，蠟層熔化，所有反應成分才會混合在一起。

人結直腸腺癌細胞；LS 174T [LS174T]

人乳腺癌細胞；MDA-MB-468

人肺支氣管癌細胞；NCI-H1650

人非小細胞肺腺癌細胞；NCI-H1975

人非小細胞肺腺癌細胞；NCI-H2087

人小細胞肺癌；NCI-H2227

人非小細胞肺癌細胞；NCI-H23

人腎上腺皮質腺癌細胞；NCI-H295R

小鼠源細胞

小鼠胚胎成纖維細胞；3T3-Swiss albino

小鼠T淋巴細胞瘤細胞；Cyc-Tag(S49)

小鼠骨髓細胞；FDC-P1

小鼠垂體瘤細胞；GT1-1

小鼠胚胎成骨細胞前體細胞；MC3T3-E1

小鼠胚胎成纖維細胞；NIH/3T3

小鼠睪丸畸胎瘤細胞；P19

小鼠胚胎成纖維細胞(來自NIH3T3)；PA12

小鼠血細胞；WEHI-3 [WEHI3]

小鼠成纖維細胞；φ2

小鼠紅白血病細胞；MEL

小鼠骨髓瘤細胞；Sp2/0-Ag14

小鼠垂體瘤細胞(分泌促生長激素分泌激素)；AtT-20

小鼠小膠質細胞；BV2

小鼠骨髓瘤細胞；Fox-NY

小鼠胚胎成纖維細胞；MEF

小鼠淋巴瘤細胞(NK靶細胞)；YAC-1

野生型人c-kit受體細胞株；A7d

小鼠原B細胞株；BaF3

小鼠腦瘤細胞；BC3H1

小鼠成肌細胞；C2C12

小鼠肝癌細胞；Hepa 1-6 [Hepa1-6]

小鼠肥大細胞瘤細胞；P815

小鼠胚胎成纖維細胞；3T6-Swiss albino

小鼠胚胎成纖維細胞；C3H 10T1/2 2A6

小鼠樹突狀細胞肉瘤細胞；DCS

小鼠淋巴瘤細胞；EL4

小鼠前胃癌細胞；MFC