細(xì)胞簡(jiǎn)介：

大鼠椎間盤(pán)纖維環(huán)分離自椎間盤(pán)組織；椎間盤(pán)是位于脊柱兩椎體之間，由軟骨板、纖維環(huán)、髓核組成的一個(gè)密封體。上下有軟骨板，是透明軟骨復(fù)蓋于椎體上，下面骺環(huán)中間的骨面。上下的軟骨板與纖維環(huán)一起將髓核密封起來(lái)。纖維環(huán)由膠原纖維束的纖維軟骨構(gòu)成，位于髓核的四周。纖維環(huán)的纖維束相互斜行交叉重疊，使纖維環(huán)成為堅(jiān)實(shí)的組織，能承受較大的彎曲和扭轉(zhuǎn)負(fù)荷。纖維環(huán)的前側(cè)及兩側(cè)較厚，而后側(cè)較薄。纖維環(huán)的前部有強(qiáng)大的前縱韌帶，后側(cè)的后縱韌帶較窄、較薄。纖維環(huán)細(xì)胞密度為9000個(gè)細(xì)胞/mm3，其外層的細(xì)胞呈梭型，主要屬于纖維細(xì)胞，內(nèi)層細(xì)胞呈圓形，主要屬于軟骨細(xì)胞。在培養(yǎng)的情況下，用透射電鏡觀察則有許多共同的超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)，它們的核較圓，核仁較明顯。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量的附有核糖體顆粒的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體多，為橢圓形，有的可看到雙層單位膜，由單位膜包繞初級(jí)深酶體和次級(jí)深酶體。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有一系列的扁平囊及小泡主成的高爾基復(fù)合體和分泌顆粒，纖維環(huán)細(xì)胞合成分泌蛋白多糖及膠原纖維的能力很旺盛，保證纖維環(huán)生理代謝活動(dòng)所需的構(gòu)造物質(zhì)的供給。一但這種供給減少，纖維環(huán)的生物性能就會(huì)減弱，椎間盤(pán)開(kāi)始退變。
方法簡(jiǎn)介：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠椎間盤(pán)纖維環(huán)采用膠原酶-中性dan白酶聯(lián)合消化法并結(jié)合軟骨細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來(lái)，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。
質(zhì)量檢測(cè)：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠椎間盤(pán)纖維環(huán)經(jīng)Ⅰ型膠原蛋白免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

1) 將5-10d的乳鼠浸泡入75%乙醇中，移入生物安全柜，

2) 從胸部解剖乳鼠，取出雙肺置于預(yù)冷的PBS中，盡可能的除去結(jié)締組織等，

3) 取肺邊緣部分，剪碎，將組織塊移入T25培養(yǎng)瓶中，倒置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，

4) 2h后，培養(yǎng)瓶中注入2 mL內(nèi)皮培養(yǎng)基，小心將培養(yǎng)瓶正置于培養(yǎng)箱，確保組織塊不會(huì)飄起來(lái)，

5) 每3d換液2mL，待細(xì)胞從組織塊中爬出來(lái)后，隔2d換液，待細(xì)胞融合達(dá)到60-70%左右時(shí)，去除組織塊，將肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞重新鋪瓶。

1、您收到細(xì)胞后，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作：

取出T-25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置4-6小時(shí)或過(guò)夜，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)，然后換用新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)或進(jìn)行傳代。

2、細(xì)胞傳代：

1）細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2）添加0.125%消化液約2ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1500rpm/min，離心5min；

3）棄上清，沉淀細(xì)胞用12ml培養(yǎng)基重懸，然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4）待細(xì)胞貼壁后，觀察培養(yǎng)結(jié)果，之后進(jìn)行換液培養(yǎng)或傳代。

3、細(xì)胞凍存：

1）細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2）添加0.125%消化液約2ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，再加入培養(yǎng)液終止消化，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1500rpm/min，離心5min；

3）用適當(dāng)量的凍存液（基礎(chǔ)培養(yǎng)基：FBS：DMSO=7:2:1）重懸細(xì)胞，并放置于凍存管中；

4）先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃ 1.5h，然后將其移入-80℃過(guò)夜，24h后轉(zhuǎn)入液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。

4、細(xì)胞復(fù)蘇：

1）從液氮中取出細(xì)胞凍存管（注意：佩戴防爆管面具）， 快速將其置入37℃水浴中解凍，直至凍存管中無(wú)結(jié)晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；

2）將凍存管中的細(xì)胞移至15ml無(wú)菌離心管中，滴加入培養(yǎng)液5ml混勻細(xì)胞，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至適當(dāng)面積大小的培養(yǎng)皿中；

3）放置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4）第二天，換用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。