（1）原代細(xì)胞選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，在凍存前一天換液。將多個(gè)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。適時(shí)去掉胰蛋白酶，加入少量新培養(yǎng)液。用吸管吸取培養(yǎng)液反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞，使其成為均勻分散的細(xì)胞懸液。懸浮細(xì)胞則不要消化處理。然后將細(xì)胞收集于離心管中離心(1000r/min，10分鐘)。
 
（2）去上清液，加入含20%小牛血清的*培養(yǎng)基，于4℃預(yù)冷15分鐘后，逐滴加入已無(wú)菌的DMSO或甘油，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，細(xì)胞濃度為5×106～1×107/mL之間。（凍存培養(yǎng)液的配置是不是一定要用小牛血清呢？答案是不一定的，具體要看培養(yǎng)的細(xì)胞類型來(lái)選擇，像有些科研君們就用corning胎牛血清,也有人用sigma的小牛血清）
 
（3）將分裝上述細(xì)胞懸液于2ml凍存管中，每管0.25ml。凍存管要將蓋子蓋緊，并標(biāo)記好原代細(xì)胞名稱和凍存日期，同時(shí)作好登記（日期、細(xì)胞種類及代次、凍存支數(shù)）。
 

（4）將裝好細(xì)胞的凍存管放到凍存盒中，-80℃冰箱過(guò)夜。；如果有程序降溫器(放在-80℃冰箱過(guò)夜，放入液氮罐);或者可以在4℃，2h;然后轉(zhuǎn)到-20℃，2h;-80℃，2h;放入液氮罐。

（5）原代細(xì)胞凍存在液氮中可以長(zhǎng)期保存，但為妥善起見，凍存半年后，取出一只凍存管細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況，然后再繼續(xù)凍存。