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細胞計數實驗中易犯的錯誤

時間:2017-9-27閱讀:203
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實驗原理:當待測ATCC細胞懸液中細胞均勻分布時,通過測定一定體積懸液中的細胞的數目,即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數目。

細胞計數實驗中初學者易犯的錯誤
具體操作:

一.準備工作:

取一瓶傳代的細胞,按照《傳代細胞培養(消化法)》中的傳代方法繁殖細胞,待長成單層后以被使用.

二.細胞懸液制備:

用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后,加入培養液(或hanks液或PBS等平衡鹽溶液),吹打制成待測細胞懸液。

三.細胞計數:

1.取一套血球計數板,將特制的蓋玻片蓋在血球計數槽上.

2.制備計數用的細胞懸液:用吸管吸5滴細胞懸液到一離心管中,加入5滴臺盼藍染液(0.4%)或苯胺黑?;罴毎粫蝗旧?,加入染液后就可以在顯微鏡下區別活細胞和死細胞。

3.將細胞懸液滴入計數板:將待測細胞懸液吹均勻,然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入,要保證蓋片下充滿懸液,注意蓋片下不要有氣泡,也不能讓懸液流入旁邊槽中。

4.統計四個大格的細胞數:將血球計數板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察,并移動計數板,當看到鏡中出現計數方格后,數出四角的四個大鉻(每個大格含有16個中鉻)中沒有被染液染上色的細胞數目。

5.計算原細胞懸液的細胞數:按照下面公式計算細胞密度:

細胞懸液的細胞數/ml=(四個大格子細胞數/4)×2×104

說明:/4因為計數了4個大格的細胞數;×2因細胞懸液:染液=1:1稀釋;×104因為計數板中每一個大格的體積為:1.0mm×1.0mm×0.1mm=0.1mm3 而 1ml=1000mm3

四.細胞計數要點:

1.進行細胞計數時,要求懸液中細胞數目不低于104個/ml,如果細胞數目很少要進行離心再懸浮于少量培養液中;

2.要求細胞懸液中的細胞分散良好,否則影響計數準確性。

3.取樣計數前,應充分混勻細胞懸液,尤其時多次取樣計數時更要注意每次取樣都要混勻,以求計數準確;

4.數細胞的原則是只數完整的細胞,若細胞聚集成團時,只按照一個細胞計算。如果細胞壓在格線上時,則只計上線,不計下線,只計右線,不計左線。

5. 操作時,注意蓋片下不能有氣泡,也不能讓懸液流入旁邊槽中,否則要重新計數。

五.初學者易犯的錯誤:

1. 計數前未將待測懸液吹打均勻。

2. 滴入細胞懸液時蓋玻片下出現氣泡。

3. 滴入懸液時的量太多,至使細胞懸液流入旁邊的槽中。

六.本實驗特殊試劑的配制:

4%臺盼藍母液:稱取4克臺盼藍,加入少量蒸餾水研磨,加雙蒸水至100毫升,用濾紙過濾,4℃保存。

使用液:使用時,用PBS稀釋母液至0.4%即可。

細胞的凍存

1.先將凍存管放入4℃冰箱,約40min。

2.接著置于-20℃冰箱,約30-60min。

3.置于-80超低溫冰箱中放置過夜。

4.置于液氮罐中長期保存。

5同時做好凍存記錄,在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。

注意事項:

1.使用DMSO前,不需要進行高壓滅菌,它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會破華它的分子結構,以至于降低冷凍保護效果。在常溫下,DMSO對人體有害,故在配制時戴上手套操作。

2.不宜將凍存細胞放置在0℃~-60℃這一溫度范圍內過久,低溫損傷主要發生在這一溫度區內,是“危險溫區”。

3.注意定期檢查液氮罐內液氮量,及時添加。

簡便方法:

胰蛋白酶液消化>>離心>>PBS液1ml洗滌,吹打制成待測細胞懸液>>取1ul懸液+9ulPBS>>細胞計數:

1.蓋好蓋玻片:取一套血球計數板,將特制的蓋玻片蓋在血球計數槽上.

2.用10ul槍頭將細胞懸液注入計數板,要保證蓋片下充滿懸液,注意蓋片下不要有氣泡,也不能讓懸液流入旁邊槽中。

3.統計四個大格的細胞數:將血球計數板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察,并移動計數板,當看到鏡中出現計數方格后,數出四角的四個大鉻(每個大格含有16個中鉻)的細胞數目。

4.計算原ATCC細胞懸液的細胞數:按照下面公式計算細胞密度:

(細胞懸液的細胞數)/ml=(四個大格子細胞數/4)×106
對照品    含量:    進口/國產    頭孢克洛    20mg/支    英文名稱    含量測定    規格:
對照品    含量:    進口/國產    苯唑西林    20mg/支    英文名稱    含量測定    規格:
對照品    含量:    進口/國產    頭孢噻肟    20mg/支    英文名稱    含量測定    規格:
對照品    含量:    進口/國產    頭孢他啶    20mg/支    英文名稱    含量測定    規格:
對照品    含量:    進口/國產    多西環素    20mg/支    英文名稱    含量測定    規格:
對照品    含量:    進口/國產    克林霉素磷酸酯    20mg/支    英文名稱    含量測定    規格:
對照品    含量:    進口/國產    土霉素    20mg/支    英文名稱    含量測定    規格:
ATCC細胞

 

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