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原代細胞培養及外源基因導入的實驗步驟

時間:2017-10-30閱讀:185
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原代細胞的傳代培養(*天) 
   1) 顯微鏡觀察母細胞的生長狀態,確定傳代比例。 
為了獲得較高的轉染效率,必需保證細胞處于合適的生長密度,因此應根據母細胞的生長密度調整傳代比例。磷酸鈣轉染的合適細胞密度為50%-70%,本實驗中使用的293細胞長成致密單層后一般按照1:6傳代即可。 
   2) 在酒精燈旁打開培養皿蓋,倒去皿中的細胞營養液,加入2mlHank’s液,輕輕搖動,將溶液倒出。 
   3) 消化與分裝。 
在培養皿中加入1ml消化液(0.53mMEDTA, 0.05%胰蛋白酶液),37°C靜置5分鐘左右,顯微鏡觀察,如果細胞變圓且彼此分離表明消化*,此時可加入10ml營養液終止消化,吹打數次,使培養皿壁上的細胞全部脫落下來,并分散形成均勻的細胞懸液。按照傳代的比例補加適當體積的營養液,吹打混勻后分裝到新的培養皿中。 
在分裝好的細胞培養皿上做好標記,置于37°C二氧化碳培養箱中培養。 
2. 用磷酸鈣介導的外源質粒轉染法在293細胞中過量表達TNF-R1(第二天) 
   1) 顯微鏡觀察待轉染細胞的生長狀態 
      a. 觀察細胞是否污染 
      b. 觀察培養液顏色的變化 
      c. 觀察細胞的生長密度 
   2) 轉染 
      a. 用微量移液器在1.5ml離心管中依次加入10μg(1μg /μl, 10μl)質粒DNA(實驗組為TNF-R1的哺乳動物細胞表達載體,對照組為空載體),350μl超純水,40μlCaCl2(2.5M)溶液,混勻。 
      b. 在另一1.5ml離心管中加入400μl2×HBS,將A液分三次緩慢加入,每次加入A液后用吹氣泡的方法混勻。室溫靜置5分鐘。 
      c. 將A,B混合液均勻地滴加在待轉染的293細胞培養液中,輕輕晃動使混勻。將培養皿置于37°C二氧化碳培養箱中。 
3. 凋亡細胞的形態觀察,“DNA Ladder”的提取及瓊脂糖電泳分析(第三天) 
   1) 顯微鏡觀察過量表達TNF-R1(實驗組)和空載體(對照組)的293細胞形態上的差異。 
   2) 用10ml玻璃吸管將實驗組和對照組培養皿中的細胞輕輕吹打下來,收集到15ml離心管中,2000rpm離心5分鐘,沉淀用1mlPBS重懸,轉移到1.5ml離心管中,2000rpm離心3分鐘,去除上清液,加入200μlPBS(0.2mg/ml 蛋白酶 K),重懸細胞,再加入200μlPBS(2%NP40),顛倒混勻,4°C作用30分鐘,期間顛倒數次。12,000rpm離心2分鐘,吸出上清,加入1ml乙醇,顛倒混勻,-20°C靜置10分鐘,12,000rpm離心10分鐘,沉淀溶于50μl水中,原代細胞加入RNaseA(10mg/ml),37°C靜置20分鐘。 
   3) 在DNA溶液中加入10μlDNA上樣緩沖液,取出50μl進行2%瓊脂糖凝膠電泳,紫外凝膠成像儀拍照。
小鼠核因子κB亞基p65親和肽(NF-κB p65)     白介素31受體aIgG    腸道菌
小鼠黑色素(MC Ab)     白介素2受體γ鏈IgG    大腸桿菌
小鼠橫紋肌輔肌動蛋白α (sm Actinin-α)     白介素2IgG    大腸菌群
小鼠紅生成素(EPO)     白介素26IgG    大腸菌群
小鼠環孢素A(CsA)     白介素-22受體IgG    大腸菌群
小鼠環孢素A(CsA)     白介素22受體結合蛋白IgG    腸道菌
小鼠環磷酸鳥苷(cGMP)     白介素-22IgG    大腸桿菌
小鼠黃體生成素釋放激素(LHRH)     白介素21受體IgG    大腸菌群
小鼠活化蛋白C(APC)      白介素21IgG    大腸菌群 糞大腸菌群 大腸桿菌
小鼠活化素A(ACV-A)     白介素20受體β鏈IgG    大腸菌群 大腸桿菌
原代細胞

 

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