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技術文章

ELISA實驗的要害在哪里?

閱讀:218發布時間:2018-3-29

優化ELISA試劑盒的重點之一在于洗滌。洗滌步驟可降低未結合抗體所引起的背景信號,從而增加分析的信噪比。每一步之間的洗滌確保只有特異的結合事件被保留,在zui后一步產生信號。而不充分的洗滌會導致差異和高背景,從而帶來不理想的結果。本文將為你介紹一些利用自動洗板機來洗滌ELISA平板的技巧。
我們可使用多種底物來檢測zui終的抗原-抗體復合物。底物分為三類:自然發光、化學發光和熒光。準確說來,ELISA這個詞指的是使用自然發光底物的分析。
洗滌參數
ELISA試劑盒一些參數會影響洗滌步驟的效果。*個主要的參數是洗滌量。自動洗板機會分配洗滌液。如果你之前遭遇過高背景,那么不要猶豫,將洗滌量調為高,是比包被體積更高。太少的洗滌液會讓一部分分析表面洗滌不到,從而明顯增加背景。所有反應孔的洗滌量必須相同。ELISA板的制造商通常會在試劑盒的使用手冊中列出包被量。行業中通常使用的包被量是200 μl。如果你的試劑盒也是這樣,那么制造商可能會建議使用300 μl洗滌液進行洗滌,以便清潔整個反應孔的壁。一般來說,洗滌量越高,則孵育步驟殘留的抗體或抗原量就越少。
洗滌次數的經驗法則
第二個影響洗滌效果的主要參數是洗滌循環的量。當然,洗滌次數越多,背景越低。然而,太多次的洗滌會降低信號強度,使其難以測定。通常的做法是在每次抗體或抗原孵育后重復洗滌三次。不過,ELISA板的制造商會對洗滌次數提出建議。一般而言,制造商包被平板需要的洗滌次數比用戶包被的平板要少。對于用戶包被的ELISA板,必須優化洗滌次數。
ELISA試劑盒控制洗滌量和洗滌次數的另一種方法是加入過量的洗滌液。一般來說,96孔板的每個孔能容納330至460 μl。不過,有些自動化洗板機可設置程序,分配遠遠超出這個量的洗滌液,比如1 ml。它是如何做到的呢?其實很簡單,就是在分液的同時打開吸液功能。換句話說,隨著分液器分配更多的液體,抽吸器也將液體吸出。這種技術能增加洗滌量,但不會溢出到其他孔中。
ELISA看起來很簡單,但是在實際操作過程中,也不能掉以輕心,還是應該仔細檢查洗滌步驟,才能獲得準確的結果。


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