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酶標ELISA試劑盒記抗體注意事項

閱讀:119發布時間:2018-2-8

ELISA試劑盒免疫酶技術中,首先要確定的變異因素就是酶標記物的工作濃度。因為酶標記物濃度的很小變化,便可導致試驗結果產生很大的波動。另外,由于濃度過高,可使非特異性反應增加,而濃度過低又可影響測定的敏感性。因此,正式試驗前必須準確滴定其工作濃度。
將抗原(或抗體)物理吸附于固相載體上,然后將經過一系列稀釋的酶標抗體(或抗Ig抗體)與吸附在載體上的抗原(或抗體)起反應,以酶與底物的顯色反應程度來確定酶標記抗體的效價,或稱工作濃度。
其步驟為:先將抗原(或抗體)用0.05M PH9.6包被緩沖液稀釋為10μg/ml左右,于聚苯乙烯板孔內加0.1ml,4℃隔夜,次日以洗滌緩沖液洗滌3次。酶標記抗體用1%BSA-PBS液依次稀釋成1∶100,1∶200,1∶400,1∶800,1∶1600……(根據據抗體的滴度而定),分別加入反應孔中,每個稀釋度二孔,每孔0.1ml,37℃孵育1小時后洗滌。然后加底物液,每孔0.1ml,37℃10~30分鐘。以2M H2SO4 0.05ml終止反應。
結果判定主要以
ELISA試劑盒比色儀讀取各孔OD值。并以OD為縱座標,結合物濃度為橫座標,繪制滴定曲線。由曲線上查得OD值為1.0左右,且曲線斜率zui大時的酶標抗體稀釋度,即為該標記物的工作濃度。
有關試驗的試劑及器材均見ELISA試劑盒部分。

C要說明的是,本法為ELISA試劑盒直接法,所測的工作濃度與在實際應用中的zui適濃度可相差幾個滴度。這就要求在建立ELISA試劑盒實驗系統中,因此基礎上還應進一步確定實際工作濃度(可采用方陣法),以達到zui適的實驗條件。
注意事項
1. 在具備高質量HRP的條件下,所要標記的抗體也要活性高,效價高(zui低1∶16),純度高,親和力好,這是保證標記物效價高,免疫活性好的首要條件。"
2. 所使用ELISA試劑盒的PH和濃度及用量必須嚴格掌握。所用試劑,(或必需)新鮮配制。如在戊二醛標記法中所用戊二醛應為新鮮純品,因戊二醛儲存過久可形成縮和體(雜質)。否則,影響標記效果。
3. 室溫攪拌時須避光,室內溫度一般在25℃為宜。標記物每次透析前,須認真檢查,防止漏液。
4.
ELISA試劑盒濃的標記物相當穩定,常加入30~40%甘油于-10℃下保存。4℃可保存1~2年,但稀釋成1∶10,只能保存數周。ELISA試劑盒已配制的使用液應在12小時內用完。切忌反復凍融。


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