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鴨胚胎肝間質(zhì)細(xì)胞永生化產(chǎn)品特性

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鴨胚胎肝間質(zhì)細(xì)胞永生化細(xì)胞特性
1)來源:上海中科院動物研究所
2)含量:>5x105個/mL
3)污染:支原體、細(xì)菌、酵母和真菌檢測為陰性
4)規(guī)格:T25瓶或者1mL凍存管包裝

細(xì)胞培養(yǎng)步驟
一.培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備:
1)準(zhǔn)備鴨胚胎肝臟間充質(zhì)干細(xì)胞*培養(yǎng)基(dmem 高糖和F12培養(yǎng)基1:1搭配,10%血清 ,1%雙抗以及1%自己配置的間質(zhì)細(xì)胞因子。)。
2)培養(yǎng)條件:氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%。溫度:37攝氏度,培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3)凍存液:90%血清,10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配,液氮儲存。
二.細(xì)胞處理:
1)復(fù)蘇細(xì)胞:將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,離心管加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4-5分鐘,棄去上清液,補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),補加培養(yǎng)基至6ml。
2)細(xì)胞傳代:如果細(xì)胞密度達80%-90%,即可進行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細(xì)胞,傳代可參考以下方法:
1.棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加1ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中,置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,若細(xì)胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加2ml*培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕打勻后吸出,在1000RPM條件下離心5分鐘,棄去上清液,加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4. 將細(xì)胞懸液按1:2到1:5比例分到新的含6ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3)細(xì)胞凍存:待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時,可進行細(xì)胞凍存。

下面T25瓶為例;
1.細(xì)胞凍存時,棄去培養(yǎng)基后,PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml*,細(xì)胞變圓脫落后,加入2ml*培養(yǎng)基終止消化,可使用血球計數(shù)板計數(shù)。
2.1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮,加DMSO至zui終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻,按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中,注意凍存管做好標(biāo)識。本公司按每個凍存管細(xì)胞數(shù)目大于1X106個細(xì)胞凍存。
3.將凍存管置于程序降溫盒中,放入-80度冰箱,至少2個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
鴨胚胎肝間質(zhì)細(xì)胞永生化注意事項: 
1. 收到細(xì)胞后,若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染,請立即與我們。
2. 所有動物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性,必須在二級生物安全臺內(nèi)操作,并請注意防護,所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。
*次處理細(xì)胞時,在超凈工作臺中打開瓶蓋,用浸透75%的酒精棉球擦拭瓶口外側(cè),以防止溢出的培養(yǎng)基污染細(xì)胞。

細(xì)胞介紹
間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是來源于早期中胚層的一類多能干細(xì)胞, 在體內(nèi)具有分布廣泛, 體外能夠大量擴增和免疫原性低等特點, 是一種細(xì)胞治療的理想種子細(xì)胞。自20世紀(jì)60年代,F(xiàn)riedenstein等發(fā)現(xiàn)在人骨髓*培養(yǎng)中, 存在一種形態(tài)類似成纖維細(xì)胞的貼壁生長的細(xì)胞且移植到小鼠體內(nèi)具有成骨能力和造血支持作用, 將這種細(xì)胞命名為骨髓基質(zhì)細(xì)胞(Bone marrow stromal cells, BMSCs)。到20世紀(jì)90年代末, 人們才成功分離一種具有成骨、成軟骨和成脂肪能力的細(xì)胞, 稱之為間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)。
隨后研究者也從其他組織, 如脂肪、臍帶、胎盤、肝臟、骨實質(zhì)和肌肉等中成功分離獲得間充質(zhì)干細(xì)胞。作為一類成體干細(xì)胞中的間充質(zhì)干細(xì)胞, 目前大部分的研究集中在人及大鼠、小鼠這兩種模式動物上, 其他動物的間充質(zhì)干細(xì)胞報道相對較少。選取中國*家禽品種鴨子為實驗材料, 以鴨胚胎肝臟中的間充質(zhì)干細(xì)胞為研究對象, 對其進行分離培養(yǎng)鑒定, 進行增殖能力檢測及分化能力鑒定, 為家禽干細(xì)胞研究及畜禽遺傳資源保存提供借鑒及參考。鴨胚胎肝間質(zhì)細(xì)胞進行慢病毒轉(zhuǎn)染8-12h,連續(xù)傳13代,采用高濃度含嘌呤霉素培養(yǎng)基(4μg/mL)培養(yǎng),篩選陽性克隆;篩選出陽性永生化鴨胚胎肝間質(zhì)細(xì)胞。
鴨胚胎肝間質(zhì)細(xì)胞永生化運輸和保存:可選擇干冰運輸及發(fā)送復(fù)蘇存活細(xì)胞方式:(1)干冰運輸,收到后立即轉(zhuǎn)入液氮凍存或直接復(fù)蘇;(2)存活細(xì)胞,收到后應(yīng)繼續(xù)生長,傳代達到細(xì)胞生長狀態(tài)良好時,再進行凍存。具體操作見細(xì)胞培養(yǎng)步驟。
細(xì)胞用途:僅供科研使用。

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