ASMS2020賽默飛線上預熱講座集錦第四期：生物大分子表征新技術
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前三期，與大家分享了新儀器的應用，蛋白組學的新技術與熱點，后這期與大家分享講座中的生物大分子表征新技術。
多樣化液相串聯(lián)質(zhì)譜技術用于完整分子量表征
近年來，隨著非變性質(zhì)譜技術的日趨成熟，生物大分子完整分子量表征方法的多樣性也隨之增加，如色譜及電泳技術與質(zhì)譜聯(lián)用等方法。
非變性質(zhì)譜進行完整分子量分析的主要優(yōu)勢包括：
1色譜高通用性；
2分析速度快且樣品使用量小；
3質(zhì)譜的高分辨性能及出色的峰容量可獲得高質(zhì)量質(zhì)譜圖。
非變性質(zhì)譜已被工業(yè)界快速接受，作為完整水平的質(zhì)量屬性監(jiān)測強有力的分析方法。此外，非變性質(zhì)譜也能夠在表征實驗室與QC實驗室之間建立強大的關聯(lián)。本講座介紹了完整分子量分析的技術重點及方法的穩(wěn)健性，包括不同質(zhì)譜平臺間方法轉(zhuǎn)換對數(shù)據(jù)的影響（從Q Exactive plus到Exploris 480）。
賽默飛完整分子量分析平臺包括Vanquish Duo雙三元超高效液相、Exploris 480超高分辨質(zhì)譜、變色龍數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)，及Protein Metrics數(shù)據(jù)分析軟件。
圖.賽默飛完整分子量分析平臺（點擊查看大圖）
01
SEC平臺
在線SEC-MS作為簡單且穩(wěn)健的分析平臺，可實現(xiàn)高通量生物大分子聚集體分析。Vanquish Duo液相平臺可以使用兩根色譜柱同時進行分析和再平衡，當一根色譜柱在分析時，另一根色譜柱在平衡，可以大程度節(jié)約分析時間，提高分析通量。
圖.Vanquish Duo實現(xiàn)高通量分析（點擊查看大圖）
經(jīng)過液相分離得到的每個色譜峰經(jīng)過質(zhì)譜檢測，能夠獲得對應的單體及聚體的分子量及糖型信息。同時，orbitrap的超高分辨性能可實現(xiàn)每個糖型的基線分離，在非變性條件下得到更準確的分子量信息。方法穩(wěn)健性的測試，連續(xù)進樣413次，每24次進一針參比品，17針參比品的色譜疊加圖顯示保留時間及色譜峰的RSD值在3%以內(nèi)。不同實驗室使用不同批次SEC色譜柱，多次技術重復實現(xiàn)結果顯示，單體及聚體的糖型含量保持一致，具有良好的重現(xiàn)性。
圖.非變性質(zhì)譜平臺的穩(wěn)健性（點擊查看大圖）
02
質(zhì)譜平臺轉(zhuǎn)移
將非變性質(zhì)譜平臺從QE Plus轉(zhuǎn)移至Exploris 480上，并做了方法驗證和對比。Exploris 480，45K分辨率時，可在保證高信噪比的同時實現(xiàn)好的分辨率，能夠分辨相差25Da的兩個糖基化修飾峰，可作為Exploris 480分析完整蛋白時合適的分辨率。上樣量從1ug到10ug遞增，譜圖均有良好的信噪比，且糖型相對含量一致。
圖.Exploris 480分辨率和上樣量參數(shù)優(yōu)化（點擊查看大圖）
QE Plus及Exploris 480的質(zhì)譜數(shù)據(jù)（多樣本且技術重復）對比顯示，在完整水平上鑒定的糖型及含量高度一致，證實了方法轉(zhuǎn)移的可行性（如下圖所示）。
圖.QE Plus及Exploris 480數(shù)據(jù)對比（點擊查看大圖）
03
CIEX平臺
通過使用可揮發(fā)性鹽流動相及PH梯度分離，可實現(xiàn)在線CIEX-MS分析，如下圖a所示，對于多種單抗混合樣品，可獲得良好的色譜分離及高質(zhì)量質(zhì)譜數(shù)據(jù)（可分辨相差幾十Da的糖化修飾峰）。穩(wěn)定性實驗中，通過CIEX-MS分析，能夠觀測到堿性峰中的琥珀酰亞胺中間體產(chǎn)物的增加（圖b）；加速穩(wěn)定性實驗中，能夠觀測到抗體片段的變化（圖c）。
圖a.CIEX-MS分析多種單抗混合物（點擊查看大圖）
圖b.CIEX-MS分析抗體穩(wěn)定性實驗中的堿性峰變化（點擊查看大圖）
圖c.CIEX-MS分析抗體加速穩(wěn)定性實驗中的片段峰變化（點擊查看大圖）
總結
生物大分子完整分子量分析在工業(yè)界已是一種廣泛認可的分析方法，多樣性的前端液相串聯(lián)質(zhì)譜（如反相，離子交換，體積排阻色譜等）平臺已被開用應用。基于orbitrap的質(zhì)譜平臺能夠獲得更高分辨及穩(wěn)健性的數(shù)據(jù)，且能夠在不同orbitrap質(zhì)譜型號間進行方法轉(zhuǎn)換。對于完整蛋白糖型表征，抗體片段分析，琥珀酰胺化修飾、氧化修飾等雜質(zhì)能夠進行高通量且準確分析。
PRCR技術與MS3在抗體Middle-down蛋白分析中的應用
ASMS 2019，賽默飛重磅推出三合一系列的創(chuàng)新dian峰之作——Thermo Scientific™ Orbitrap Eclipse™質(zhì)譜儀，*的PTCR技術可通過氣相的離子-離子相互作用，將蛋白質(zhì)的質(zhì)子轉(zhuǎn)移給特定的化合物（C??F??），從而造成蛋白質(zhì)本身電荷減少，得到一系列的電荷減少離子。
以NIST mAb為例，進行middle-down分析前，先使用Ides酶對單抗進行酶切，然后將單抗還原成LC，F(xiàn)d，F(xiàn)c三條分子量約為25kDa的亞基。以分子量大的Fd的序列覆蓋結果為例，單獨使用ETD的Fd序列覆蓋度為52%。ETD碎裂模式結合PTCR-MS3可以將序列覆蓋度提高至63%，同時使用PTCR后對于分子量大于5kDa的碎片識別率有了顯著的提高。
常規(guī)的PTCR-MS3分析會將二級碎片按照質(zhì)荷比進行分段，成為兩個質(zhì)譜分析方法，分多針進樣分析。為了減少進樣數(shù)量，在一針方法里實現(xiàn)多段質(zhì)量軸的二級碎片的PTCR反應，可結合SPS同步母離子掃描技術。以UVPD碎裂為例，將SPS窗口設置為目標質(zhì)量范圍，實現(xiàn)一針進樣，多段分子量的PTCR分析。
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