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上海莼試生物技術(shù)有限公司
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細胞分離技術(shù)

時間:2017/7/11閱讀:250
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一、細胞培養(yǎng)將組織塊分離(散)成細胞懸液的方法有多種,常用的是機械解離細胞法、酶學(xué)解離細胞法以及螯合劑解離細胞法。
從原代組織中獲得單細胞懸液的一般方法是酶解聚。細胞暴露在酶中的時間要盡可能的短,以保持大的活性。下列步驟可以解聚整個組織,獲得較高產(chǎn)量的有活性細胞。
1、* (Trypsin)
在去除不需要的組織后,使用無菌的*和剪子把剩余的組織切成3~4mm小片,通過懸浮在無鈣鎂的*中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀,去除上清液。重復(fù)清洗2到3次。
將盛有組織碎片的容器置于冰上,去除殘留的上清液。加入0.25%溶解在無鈣鎂的*中的*(100mg組織加入1ml *)。
在4℃孵育6到18小時,使幾乎沒有*活性的酶盡可能滲透進去。
移棄組織碎片中的*,在37℃孵育包含殘留*的組織碎片20到30分鐘。
在組織碎片加入熱的*培養(yǎng)基,用移液管輕輕地分散組織。如果使用無血清培養(yǎng)基,要加入大豆*抑制劑。
通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)(100~200mm)過濾,分散所有剩余組織。計數(shù)和接種細胞,進行培養(yǎng)。
2、膠原酶 (Collagenase)
用無菌*和剪子把剩余組織切成3~4mm小片,用Hanks'平衡液(HBSS)清洗組織碎片幾次。
加入膠原酶(50~200單位/ml,溶解在HBSS中)。
在37℃孵育4到18小時。加入3mM CaCl2增加解離效率。
通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細胞懸液,以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進一步的解聚,在碎片中加入新鮮的膠原酶。
通過離心在HBSS中清洗懸液幾次。
再一次在培養(yǎng)基中懸浮細胞,計數(shù)和接種細胞,進行培養(yǎng)。
3、Dispase
用無菌*和剪子把剩余組織切成3~4mm小片,用不含鈣鎂的*清洗組織碎片幾次。加入Dispase(0.6~2.4單位/ml 溶解在無鈣鎂的*)在37℃孵育20分鐘到幾個小時。
通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細胞懸液,以分離分散細胞培養(yǎng)、組織碎片和較大的碎片。如果需要進一步的解聚,在碎片中加入新鮮的Dispase。通過離心在*中清洗懸液幾次。再一次在培養(yǎng)基中懸浮細胞,計數(shù)和接種細胞,進行培養(yǎng)。
二、從原培養(yǎng)容器中分離細胞:以下是從基層迅速分離細胞,且保持細胞完整性的一般步驟。這一步驟并不意味著對于所有細胞系的廣泛應(yīng)用,每一種系統(tǒng)條件和施用濃度應(yīng)該根據(jù)經(jīng)驗加以確定。再次培養(yǎng)時檢測細胞的活性。細胞的活率應(yīng)該超過90%對于無血清培養(yǎng)基,降低*使用量。
1、移棄使用過的細胞培養(yǎng)基。
2、使用不包含有鈣鎂的*或EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid,乙二胺四乙酸.)清洗細胞(看表確定正確的清洗溶液)。在培養(yǎng)瓶對著細胞的一面加入清洗溶液,通過轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶1到2分鐘清洗細胞層,然后去除清洗液。
3、以2~3ml/25cm2的量,加選擇的分離液(見表)到培養(yǎng)瓶對著細胞的一面。確保分離液覆蓋細胞層。在37℃孵育培養(yǎng)瓶,輕輕搖動培養(yǎng)瓶。通常,在5到15分鐘內(nèi),細胞就會脫落。細胞分離需要的時間因細胞系不同而有所變化。仔細監(jiān)測細胞分離過程,避免細胞受損傷。對難于從培養(yǎng)瓶基層分離的細胞系,可以輕輕敲打,以加速分離過程。
4、當(dāng)細胞*分離時,垂直放置培養(yǎng)瓶,讓細胞流到培養(yǎng)瓶的底部。在培養(yǎng)瓶中加入*培養(yǎng)基,通過移液管在單層細胞表面反復(fù)吹打來分散細胞培養(yǎng)。計數(shù)并再次培養(yǎng)細胞。
5、對于無血清培養(yǎng)基,加入大豆*抑制劑。通常使用1∶1(v∶v)0.25mg/ml*抑制劑到*中將抑制*活性。

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