1 細胞凋亡檢測原理和方法

細胞因子的發現依賴于其生物學活性，因此，建立了生物分析法用于細胞因子的檢測。隨后，用于檢測實驗溶液(如組織培養上清液)中細胞因子的免疫分析法被建立，并不斷用于實驗室研究。但準確地、可重復地測定細胞因子具有一定困難，主要原因是*的細胞因子的含量極低(大部分都是以pmol/L計)，同時存在著源于異嗜性抗體，類風濕因子以及特異的和非特異的細胞因子結合蛋白等[1，2] 的顯著干擾。

細胞因子生物學活性檢測和濃度測定的分析方法主要有以下幾類[3] 。

1.1 生物分析法 生物分析法方便，敏感性高，但所有細胞系有可能受幾種細胞因子的影響，特異性則較差。又由于可溶性細胞因子受體等抑制劑的存在，使生物分析法可能低估細胞因子的活性。常用的方法有2種:(1)依賴性細胞株增敏實驗。一些腫瘤細胞株依賴于細胞因子方能在體外增殖，如TF-1細胞株依賴于GM-CSF和IL-3[4，5] ，CTLL細胞株依賴于IL-2，TTD-1細胞株依賴于IL-6等 [4] ?？衫眠@些依賴株檢測相應的細胞因子。但是，并非所有細胞因子均有相應的依賴株，因此限制了此法的應用。(2)功能檢測實驗。利用一些細胞因子的功能特性而建立相應的活性測定方法。如IFN抗病毒實驗和tnf對L 929 細胞的殺傷作用等[4] 。此外，生物分析法還有骨髓集落形成實驗，細胞毒或細胞抑制實驗，次級分子分泌的誘導，化學趨化和細胞因子分泌性的抑制實驗等。

1.2 免疫分析法 利用抗原機體反應的原理，制備出抗細胞因子的單抗或多抗，可進行細胞因子的免疫檢測，它包括放免實驗(RIA)和酶聯免疫吸附實驗(ELISA)等。其優點是高特異性、高靈敏度、操作簡便。缺點是不能證明被測細胞因子是否為具有完整生物活性結構的蛋白質而非變性蛋白質。

1.3 CKmRNA的測定 (1)分子雜交實驗:首先制備出細胞因子的基因探針，通過分子雜交檢測細胞內CKmRNA的表達。(2)逆轉錄PCR(RT-PCR)法技術:可快速、靈敏地檢測表達很低的CKmRNA，并可同時測定同一樣本中多種CKmRNA，操作過程包括細胞因子產生細胞的RNA提取，mRNA經逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，在細胞因子引物的引導下，即可進行PCR擴增。根據定量CKmRNA方法和原理的不同，可分為半定量PCR法，競爭性定量PCR法，內參標定量PCR法，HPLC-PCR法和酶聯免疫定量PCR法 [6] 。目前市售的商品試劑盒已能用于大多數細胞因子的檢測，但因其價格昂貴而阻礙了其廣泛使用。同時，人細胞因子的測定仍存在許多問題，檢測方法選擇不當可能得到不一致的結果，有時有必要選擇一個以上的檢測方法測定細胞因子。

2 靈敏度

細胞因子具有很強的生物學活性，其生物分析法的靈敏度*。然而，在測定血漿中細胞因子正常濃度時，難以確定免疫分析法令人滿意的靈敏度。不同細胞因子的參考值變化很大，難以定義其參考值范圍。如Damas等[7] 在研 究細胞因子與敗血癥時，使用兩步免疫放射測定實驗(IRˉMA)測定IL-6(靈敏度:5ng/ml)一步IRMA法測定TNF-α(靈敏度:5ng/L)和IL-1β(靈敏度:4ng/L)，在正常血清中未測得上述細胞因子。而Riikonen等使用具有相似檢測限的RIA法，在20例健康兒童中，IL-1β的平均濃度為12.1ng/L，IL-6的平均濃度為83ng/L;在71例健康兒童中，TNF-α的平均濃度為40±2ng/L。由此可見，不同的免疫分析方法之間存在*的差異，其靈敏度變化可能是由于其準確度和特異性的不同而引起。

3 準確度和特異性

影響細胞因子檢測準確度和特異性的因素有:(1)抗體:單抗的表位識別;(2)細胞因子:多種分子形式，結合蛋白復合物、抑制劑和可溶性受體復合物;(3)血漿基質:干擾抗體，異嗜性抗體和類風濕因子;(4)標準:重組參考物質可能不顯示與樣品平行的劑量———反應曲線。

3.1 細胞因子結合蛋白 已知IL-1β、TNF-α和IL-6能結合從細胞進入血漿的可溶性受體或特異的拮抗劑。免疫分析法是否能識別這樣的結合形式幾乎是未知的，但是對TNF的研究得出了一些重要結論。20世紀80年代后期，《Lancet》上發表了大量關于癌癥病人TNF-α測定缺乏可靠性和生物分析法與免疫分析法關系的文章。但使用競爭性免疫分析法時，癌癥病人與敗血癥病人的TNF-α是可被檢測的。而ELISA法由于不能測定TNF-α與P 55 TNF受體的結合物而無法測定癌癥病人血漿中的TNF-α。

3.2 血漿中包含幾種形式的IL-6分子，它們與一些抗血清的作用較弱，缺乏生物學活性并與其它血漿蛋白質以及IL-6的可溶性受體組成復合物。已知IL-6免疫分析法和生物分析測定其在正常血清中的濃度為0或在10～75ng/L范圍，敗血癥病人的IL-6濃度升高到1～2μg/L，腦膜炎病人的IL-6濃度升到200μg/L。然而，May等說明大多數的檢測方法僅僅測定了低分子量的IL-6，他們采用能識別IL-6高分子量的單抗，測得在正常血清中IL-6的濃度為1～10μg/L，并且在1例骨髓移植后病人的血清樣品中，測得IL-6的濃度為5～10mg/L。

3.3 多種分子的形式 一些細胞因子的多種分子形式已被充分認識，但是其對細胞因子測定影響的重要性并未得到*的研究。IL-6是一個的例子，它由一個位于第7染色體上，包含5個外顯子的單一多杰基因編碼。其氨基酸序列包括幾個潛在的O-糖基位點，2個N-糖基位點和幾個*磷酸化位點。由細菌產生的重組IL-6的相對分子量為21Kd。人成纖維細胞至少分泌6種形式，相對分子量為23～30Kd的IL-6，它們均是糖蛋白，能在敗血癥病人的血漿中被檢測。人內皮細胞分泌一種分子量為45Kd的IL-6，它似乎是血漿中的IL-6的主要存在形式。

3.4 人血漿中的干擾物質 血漿中通常包含有與IgG反應的抗體。細胞凋亡檢測這些異嗜性的抗體可影響夾心免疫分析法，它們在俘獲抗體和被標記的抗體間形成橋梁，而錯誤地導致高分析值。研究表明，15%～40%的病人樣本中含有能夠干擾檢測的抗體。異嗜性抗體能與鼠、兔和牛血清免疫球蛋白發生反應，在大多數情況下，它們與牛IgG的結合強。在檢測中，加入正常的非免疫動物血清吸附異嗜性抗體，常能夠消除這種形式的干擾。

3.5 類風濕因子是IgM的自身抗體 Hamilton等的研究說明，IgM類風濕因子與鼠IgG的結合發生于1%的健康獻血者和31%的類風濕關節炎病人。然而，也有研究表明，在9.1%的正常獻血者中發生了這類結合。這些抗體可造成與異嗜性抗體*相同的影響，并且他們在對細胞因子檢測具有特別意義的類風濕病患者中的濃度*。

*    2～8℃    二苯基聯苯胺    10毫升
進口/國產    2～8℃    乙胺鹽酸鹽    10毫升
*    RT    1，7-庚二胺    25克
*        丙二酰胺    100克
*        N-甲基乙酰胺    500克
進口/國產    保存：-20℃    4-硝基乙酰苯胺    1克
*    保存：-20℃    正丙醇胺    100毫克
*    2～8℃    異丙醇胺    1克
*        水楊酰苯胺    5克
進口/國產    2～8℃    丁二酰亞胺    250毫克
*        對氨基苯磺酰胺    1克
*    保存：-20℃    甲苯-4-磺酰胺    100毫克
*        三異戊胺    500毫克
進口/國產        鹽酸三乙胺    1克
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