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上海莼試生物技術(shù)有限公司
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細胞凋亡檢測操作步驟的分享

時間:2018-3-12閱讀:102
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細胞凋亡檢測發(fā)生時,內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶將分解核小體區(qū)間的雙鏈DNA,但核小體本身由于由組蛋白緊密結(jié)合而免受切割,單克隆抗體可以與核小體形成夾心結(jié)構(gòu),可通過檢測核小體判斷細胞是否經(jīng)歷凋亡事件。

(一) 原理
細胞凋亡的發(fā)生,是由于鈣-鎂依賴性核酸酶進入核小體間切割DNA,產(chǎn)生180bp~200bp或其倍數(shù)的核小體片段。而核小體由于與組蛋白H2A、H2B、H3和H4形成緊密復(fù)合物而不被核酸內(nèi)切酶切割。采用雙抗體夾心酶免疫法,應(yīng)用小鼠抗DNA和抗組蛋白的單克隆抗體,與核小體片段形成夾心結(jié)構(gòu),可特異性檢測細胞溶解物中的核小體片段。

(二)材料與試劑
1.采用Boehringer Mannheim公司試劑盒,生物標記的小鼠抗組蛋白單克隆抗
體。
2.過氧化物酶(-POD)標記的小鼠抗DNA單克隆抗體
3.鏈霉親合素包被的微孔板
4.DNA-組蛋白復(fù)合物,作為陰性對照。
5.ABTS底物
6.溶解緩沖液
7.溫育緩沖液
8.底物緩沖液

(三)樣品
1.培養(yǎng)細胞或離體細胞的裂解物細胞裂解步驟:收集細胞,離心后,用200μl溶細胞緩沖液重新懸浮,室溫下作用30min。
2.培養(yǎng)細胞的上清液
3.血漿(血清)

(四)操作方法
1.取樣品離心后(1 000r/min,10min),吸取20μl上清液,加入鏈霉親合素包被的培養(yǎng)板孔中。
2.另加入80μl免疫反應(yīng)試劑含抗-DNA-POD、抗組蛋白-*及溫育緩沖液(按1︰1︰18混合),室溫下孵育2h(置搖床上,250r/min)。
3.取上清,用300μl溫育緩沖液洗滌3次,小心移去洗滌液。
4.加入100μl底物緩沖液,室溫下孵育使顏色變化至適合(置搖床上)。
5.盡快作比色分析(10min~20min內(nèi)),用底物緩沖液作空白對照,以波長405nm,參考波長492nm進行檢測。

(五)細胞凋亡檢測結(jié)果判定
按下列公式計算細胞釋放的單/低聚核小體片段的特別聚集值:
注:mU=吸收值(10-3)=雙孔吸收值的平均OD值-底物OD值,若樣品的吸收值超過比色測定范圍,應(yīng)適當稀釋后再檢測。
容量:        1公斤    shēng huà shì jì        液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基
容量:    RT    40克    shēng huà shì jì        液體改良馬丁培養(yǎng)基(含瓊脂)
容量:        250毫升    shēng huà shì jì        液體改良馬丁培養(yǎng)基
容量:        50張/盒    shēng huà shì jì        *測定培養(yǎng)基
容量:        25克    shēng huà shì jì        *鹽
容量:        100克    shēng huà shì jì        葉綠素B
容量:    2~8℃    5克    shēng huà shì jì        葉綠素A
容量:    RT    支    shēng huà shì jì        耶爾森氏菌顯色培養(yǎng)基
容量:        100克    shēng huà shì jì        氧氯化鋯
容量:    RT    25克    shēng huà shì jì        氧化鍺
細胞凋亡檢測

 

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