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一、目的

學習原代培養方法，從供體取得組織細胞后在體外進行的培養。

二、概述

組織塊培養法是常用的、簡便易行和成功率較高的原代培養方法。可以采用剪切法，即將組織塊剪切成小塊后，接種于培養瓶，組織小塊貼壁24h或更長時間后，細胞就從組織四周游出。但由于在反復剪切和接種過程中對組織塊的損傷，并不是每個小塊都能長出細胞。用于組織塊培養的培養瓶可根據不同細胞生長的需要作適當處理，如預先涂以膠原薄層，以利于上皮樣細胞等的生長。（本節以新生牛主動脈平滑肌培養為例）

三、材料

（一）儀器

1.凈化工作臺

2.恒溫水浴箱

3.冰箱（4℃、-20℃）

4.倒置相差顯微鏡

5.培養箱

（二）玻璃器皿

1.培養皿（Φ100mm）

2.吸管（彎頭）

3.燒杯（500ml、200ml、10ml）

4.廣口試劑瓶（500ml）

5.玻璃瓶（250ml、100ml）

6.培養瓶

7.廢液缸

（三）塑料器皿

1.吸頭

2.槍頭

3.膠塞

4.EP管

（四）其他物品

1.微量加樣槍

2.眼科組織剪（直尖、彎）

3.眼科組織鑷（直、彎）

4.12.5cm組織鑷（無鉤、1×2鉤）

5.25cm敷料鑷（無鉤）

6.止血鉗（18cm直紋式、12.5cm直紋式、彎紋式）

7.解剖剪

（五）試劑

1.D-Hanks液

2.小牛血清

3.RPMI1640

4.雙抗

5.1N HCl

6.7.4%NaHCO3

四、操作步驟

1.取材：打開胸腔，無菌操作下取出主動脈胸段，浸到預先配制好的含雙抗（500u/ml青、鏈酶素）的D-Hanks液中漂洗。                                                                                                                                

2.組織的沖洗、修剪：取出主動脈，用鋒利的剪刀修剪除去周圍組織，再用D-Hanks沖洗主動脈3次，除去雜組織等。

3.平滑肌組織分離：縱向剖開主動脈，撕下主動脈內層，取主動脈中層的平滑肌組織，無血清RPMI1640漂洗3次。

4.剪切：將平滑肌組織用鋒利的眼科剪反復剪切至剪成1mm3小塊，在剪切過程中，可以適當向組織中滴加1～2滴培養液，以保持濕潤。

5.貼塊：將剪切好的組織小塊，用眼科鑷送入培養瓶內，用彎頭吸管將組織塊均勻擺置，每小塊間距0.5cm左右，組織塊放置好后，輕輕將培養瓶翻轉，讓瓶底朝上，向瓶內注入適量含10%牛血清培養液，蓋好瓶蓋。

6.培養：將培養瓶瓶底朝上，37℃培養箱放置2～4h，待組織小塊貼附后，將培養瓶慢慢翻轉平放，靜置培養。

7.換液：原代培養3～5d，需換液一次，去除漂浮的組織塊和殘留的血細胞。  

組織塊培養法也可不用翻轉法，即在擺放組織塊后，向培養瓶內僅加入少量培養液，以能保持組織塊濕潤即可，蓋好瓶蓋，放置37℃培養箱24h再補加培養液。

注意事項

1.取材的組織盡快培養。因故不能即時培養，可將組織浸泡于培養液內，放置于冰浴或4℃冰箱中，如果組織塊很大，應切成1cm3以下的小塊再低溫保存，但時間不能超過24h。

2.從消化道、周圍有壞死組織等污染因素存在的區域取材，可用含500～1000u/ml的青、BSS液漂洗5～10min，或用10%注射液沖洗浸泡10min再作培養。

3.組織塊不易貼壁，可預先在瓶壁涂薄層血清、胎汁或鼠尾膠等。

4.原代培養的1～2d內要特別注意觀察是否有細菌、霉菌的污染，一旦發現，要及時清除。

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