做蛋白表達實驗的時候，有時候實驗會覺得參考實驗方法和ke隆的蛋白基因序列沒有問題，蛋白電泳就是沒有結果。今天就一起來探討一下蛋白質不表達的原因有哪些呢？
1.載體構建錯誤
這個屢見不鮮，很多新人經常弄錯讀碼框。比如Qiagen的pQE系列載體，其ke隆位點常有一兩個堿基的區別；另外有些酶產生粘端有些酶產生平端，這些都容易導致讀碼框錯誤，從而表達不出來。
2.宿主菌選擇不當
不同的宿主菌其基因型是不一樣的。有些經過特殊修飾的載體，或者特殊用途的載體，或者有特殊啟動子的載體，必須選擇合適的宿主菌進行表達。因此，當你的蛋白沒有表達出來時，可以考慮更換宿主菌。
3.密碼子的使用頻率低
有些基因其本身含有許多稀有密碼子，尤其是起始密碼之后的15個堿基之內的稀有密碼子，對蛋白表達有著很重要的影響。優化密碼子對原核表達似乎效果很好，對真核表達系統未見得有很好的效果。曾經有某人在畢赤酵母表達某蛋白兩年未果，試圖將密碼子優化進行表達，結果還是沒有表達。一氣之下將該優化的基因序列克隆到原核表達載體，表達量居然出奇地高！這是一個辛酸的笑話，但是一個真實的故事。但是有一點我可以有很大把握的說：對于真核表達，密碼子優化只能起錦上添花的作用（確認有表達，以此來提高表達量），而不能雪中送炭（沒有表達出來，通過密碼子優化極有可能不奏效）。
4.質粒不穩定或者質粒丟失
pET系統通常比較穩定。但是你選用帶氨芐青霉su抗性的載體時，也許有可能產生β-lactamase降解了抗生素，使質粒丟失。還有一種情況是表達重組的毒素蛋白，對宿主細胞也有毒性，造成質粒丟失。這種情況多見于真核表達系統。
5.蛋白酶將蛋白降解了
這種情況常由重組蛋白本身的N-或C-端序列引起的。當蛋白N-端是Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或 Tyr這些氨基酸時，容易遭受蛋白酶降解，此即N-末端規則。N-端是Met時，大腸桿菌可以悄悄地把這個Met偷走，特別是Met后緊跟著一個帶小側鏈的氨基酸時。C-末端存在非極性氨基酸時，也容易導致蛋白被降解。C末端最后5個氨基酸是極性的或者帶電荷的，則不易被降解。
6.二級翻譯起始位點
這種情況見于你的序列里正好含有和核糖體結合位點一致的序列。那就怪不得人家了，核糖體會很高興地找到這個位點，然后開始翻譯，致使你的蛋白被截短，在電泳時看不到預期大小的片段。
7.SD序列
這個不陌生吧？考研時老師喜歡出名詞解釋，也難怪人家老是拿這個出題----SD序列和起始密碼子序列（80%是AUG，也有GUG的）之間的距離，對蛋白表達的效率也有著非常重要的影響。SD序列本身的組成對翻譯效率也有影響。有時為了減少包涵體的產生，還特別對SD序列進行修飾呢！
8.mRNA的二級結構
在克隆之前，你得看看你的序列里是否有和核糖體結合位點和/或翻譯起始位點互補的序列。如然，你最好進行同義密碼子替換。否則由此形成的mRNA二級結構，會讓翻譯嘎然而止的。
9.意外終止
這種情況見于PCR擴增序列時，會和你開個不大不小的玩笑。比如它會將序列中間TAC突變為TAA，讓你的蛋白翻譯剎車。所以在進行表達之前，一定要進行測序，避免這種情況的發生。
10.轉錄終止子
轉錄終止子的存在可以促進蛋白表達；但是缺少時就會造成“通讀”，沒完沒了地讀下去。這在pET系統里不成問題，因為它在靶基因的相反方向有個選擇性的標記基因。如果你的靶基因正好和這個標記基因方向一致，那么你得看看你的靶基因后是否有個轉錄終止子。如果沒有的話，它們會競爭得天昏地暗，搶著生成mRNA和蛋白質。
11.mRNA的不穩定性
靶基因的mRNA常聚集于細胞內。但是大腸菌的mRNA及其不穩定。如果在mRNA的5"-非翻譯區和3‘-rho非依賴性終止子處插入穩定結構序列，可以促進mRNA的穩定性。尤其是5"末端要是有個不帶突出的發夾結構，能讓mRNA在胞漿內無生命之虞。
12.檢測方法的可行性
有時候，蛋白的確表達了，只是表達量特別低，或者和雜帶靠得特別近，致使你錯誤地以為蛋白沒有表達。這時候，你可千萬別忘記了生物學實驗的兩大黃金準則：對照和重復。說到對照，有很多層意思。最基本的意思是，要設立空載體對照。在真核系統表達的蛋白，常常量特別低。因此你不要老是想著WB和SDS-PAGE去檢測。這時候，你必須多看文獻，另辟蹊徑，從文獻中找找看這個蛋白有米有很特別的性質----比如說如果它具有酶活性，那簡直就是便宜你了。還比如說，某些蛋白具有異樣性質，比如說流感病毒的HA，你拿表達的不同梯度稀釋的蛋白做個血凝。如果發生血凝，并且呈現一定的梯度關系，那簡直就是板上釘釘的事情了。
以上就是關于蛋白質不表達的原因有哪些的問題解答。如果你想了解更多請咨詢百奧創新客服！
儀表網手機版
儀表網小程序
公眾號：ybzhan
掃碼關注視頻號
手機版
官方微信
采購中心
